- ▶ 제 8. 일반시험법 ▶ 8. 식품 중 잔류동물용의약품시험법 ▶ 8.1 일반사항 ▶ 8.2 정성시험법 ▶ 8.2.1 생물학적 시험법
1) 시험법 적용범위
축․수산물 등에 적용한다.2) 분석원리
시료중 테트라싸이클린계, 마크로라이드계, 페니실린계, 아미노글리코사이 드계, 설폰아마이드계, 퀴놀론계, 세팔로스포린계, 펩타이드계, 폴리에테르계 ,노보비오신(Novobiocin) 등의 항생물질 및 합성항균제의 잔류여부를 계통별로 확인한다.3) 시약 및 시액
가) 배지
(1) 계대, 증식용: nutrient agar
(2) 증균용: tryptic soy broth (이하 TSB라 한다.)
(3) 시험용: antibiotic medium No. 2 (pH 6.55±0.05, 이하 AM #2라 한다.)
antibiotic medium No. 5 (pH 7.9±0.1, 이하 AM #5라 한다.)
antibiotic medium No. 8 (pH 5.85±0.05, 이하 AM #8라 한다.)
Mueller Hinton medium(pH 7.3±0.1, 이하 MH라 한다.)
test agar pH 6.0 (pH 6.0, 이하 TA라 한다.)
EEC agar pH 8.0 (물 1 L당 peptone 6.9 g, NaCl 5.1 g, KH2PO4 1.0 g 및 Agar 13.0 g, 이하 EEC라 한다.)
(4) 아포 조제용: A-K #2 sporulating agar(BBL) 또는 nutrient agar (MnSO4∙H2O 0.005% 첨가)
나) 시험균액
(1)B. megaterium(Bacillus megaterium ATCC 9885) 아포액(spore suspension, 포자현탁액)
보통배지에 계대배양(subculture)하여 보관한 시험균을 37℃에서 1일간 배양한 후 멸균생리식염수 2～3 mL에 현탁시킨 후 아포조제용 배지 300 mL를 넣어 굳힌 배양병(roux bottle)에 접종하여 37℃에서 1일간 배양 후 실온에서 6일간 아포를 형성시킨다. 멸균유리구슬과 멸균수 25 mL를 넣어 집균한 후 65℃에서 30분간 가열한 후3,000G으로 20분간 원심분리하여 상층액을 제거한 다음 다시멸균수에 부유시켜 세척을 3회 이상 반복하고잔류물을멸균수에 부유시켜 65℃에서 30분간 재가열한다. 이를멸균수로 10단계 희석하여 표준한천배지로 균수를 측정한 후 아포농도를2×108CFU/mL가 되도록 희석하여 사용한다. 장기간 보관 시에는 냉동보관 한다.
(2)B. subtilis(Bacillus subtilis subsp. spizizenii ATCC 6633) 및 B. cereus (Bacillus cereus ATCC 11778)의 아포액(spore suspension, 포자현탁액)
Nutrient agar에 계대배양(subculture)하여 보관한 시험균을 멸균생리식염수 5 mL에 현탁시킨 후 nutrient agar 300 mL를 넣어 굳힌 배양병에 접종하여 37℃에서 1일간 배양한 후 멸균생리식염수 2～3 mL에 현탁시킨 후 아포조제용 배지 300 mL를 넣어 굳힌 배양병에 접종하여 37℃에서 1일간 배양한 후 실온에서 6일간 아포를 형성시킨다. 멸균유리구슬과멸균수25 mL를 넣어 집균하여 65℃에서 30분간 가열한 후3,000G로10분간 원심분리하여 상층액을 제거한 다음 다시멸균수에 부유시켜 세척을 반복하고잔류물을 멸균수에 부유시켜 65℃에서 30분간 재가열한다. 이를 멸균수로 10단계 희석하여 표준한천배지로 균수를 측정한 후 아포농도를9×106CFU/mL 정도 되도록멸균수로 희석 소분하고 냉장보관하여 사용한다. 장기간 보관 시에는 냉동보관한다.
(3)G. stearothermophilus(Geobacillus stearothermophilus ATCC 10149)의 아포액(spore suspension, 포자현탁액)
Nutrient agar에 계대, 보관되어온 균주를 멸균생리식염수 5 mL에 현탁시킨 후 nutrient agar 300 mL를 넣어 굳힌 배양병에 접종하여 시험균을 55℃에서 1일간 배양한 후 멸균생리식염수 2～3 mL에 현탁시킨 후 아포조제용 배지 300 mL를 넣어 굳힌 배양병에 접종하여 55℃에서 1주일간 배양한다. 멸균유리구슬과멸균수25 mL를 넣어 집균한 후 85℃에서 15분간 가열한 후3,000G로10분간 원심분리하여 상층액을 제거한 다음 다시멸균수에 부유시켜 세척을 3회 이상 반복하고잔류물을 멸균수에 부유시켜 85℃에서 15분간 가열한 후멸균수로 10단계 희석하여 표준한천배지로 균수를 측정한 후 아포액(spore suspension, 포자현탁액)의 농도를7×106CFU/mL 정도되도록 희석 소분하여 냉장 보관한다. 장기간 보관 시에는 냉동보관한다.
(4)E. coli(Escherichia coli ATCC 11303) 및 K. rhizophila (Kocuria rhizophila ATCC 9341)의 균액
시험일 하루 전 Triptic soy broth 20 mL에 계대 보존균을 직경 2 mm 백금이로 1 loopful을 접종하여 32℃(K. rhizophila), 37℃(E. coli )항온수조에서 16시간 흔들어 섞어 배양한다. 이 균액 1 mL를 멸균수19 mL에 희석하여 사용하며(이때 균농도는 약 2×107CFU/mL), 이 희석 균액은 4℃ 냉장보관하면서 약 1주일간 사용할 수 있다.
다)TMP(trimethoprim)용액: TMP 10 mg을 용량플라스크에 달아 메탄올10 mL에 녹이고멸균수를넣어 100 mL로 한 후 15mg/L용액이 되도록희석하여B. megaterium평판 조제 시 사용한다.
라) 페트리접시: 안지름 85±1 mm, 높이 20 mm의 밑면이 평평한 것
마) 디스크: 직경 10 mm, 펄프디스크(흡수량 0.07～0.08 mL)
바) 시험용 평판 검사용 감수성 디스크: 스트렙토마이신 감수성 디스크(직경 6 mm, 10 μg)
사) 착즙기
4) 시험용 평판의 조제
가)B. megaterium평판
멸균 후 약 50℃로 가온 보존된 MH 배지 100 mL당 조제된 시험균액 1 mL와 TMP용액 1 mL를 넣고 충분히 섞은 후 페트리접시에 8 mL씩 분주하여 수평으로 유지하여 응고시킨다.
나)B. subtilis평판
멸균 후 약 50℃로 가온 보존된 AM #5 배지에 100 mL당 조제된 시험균액1 mL를 넣고 충분히 섞은 후B. megaterium평판과 같이 조작한다.
다)B. cereus평판
멸균 후 약 50℃로 가온 보존된 AM #8 배지에 100 mL당 조제된 시험균액1 mL를 넣고 충분히 섞은 후B. megaterium평판과 같이 조작한다.
라)G. stearothermophilus평판
멸균 후 약 50℃ 온도에서 보존된 AM #2 배지에 100 mL당 조제된 시험균액 1 mL를넣고충분히 섞은 후B. megaterium평판과 같이 조작한다.
마)E. coli평판
멸균 후 약 50℃로 가온 보존된 TA 배지에 100 mL당 조제된 시험균액 1 mL를 넣고 충분히 섞은 후B.megaterium평판과 같이 조작한다.
바)K. rhizophila평판
멸균 후 약 50℃로 가온 보존된 EEC 배지에 100 mL당 조제된 시험균액 1 mL를 넣고 충분히 섞은 후B. megaterium평판과 같이 조작한다.
5) 시험용 평판의 검사
시험할 때마다 스트렙토마이신 감수성 디스크(10 μg)를 이용하여 각 시험용평판의 감도를 확인한다. 즉,B. megaterium,B. cereus,B. subtilis,B. stearothermophilus,및K. rhizophila평판에서는 스트렙토마이신 감수성 디스크의 저지환의 직경이 각 20 mm 이상 되는 평판을 사용하고E. coli의 평판의 경우 직경이 약 15 mm 이상이 되는 것을 사용한다.
6) 시험조작
가) 짜내기법
시료를 가능한 한 무균적으로 잘게 잘라서 시료의 즙을짜낸 뒤 그 즙을 디스크에 흡수시킨다. 흡수시킨 디스크를 검사용 평판 위에 놓는다.B. megaterium는 45℃,B. subtilis와E. coli는 37℃,B. cereus와K. rhizophila는 30℃,B. stearothermophilus는 55℃에서 16～18시간 배양한다.
나) 디스크 삽입법
유(乳)의 경우,시료(다만, 분유류는 14% 수용액으로 조제)를 충분히 혼합하여 82℃로 2.5분간 가열 후 신속히 식혀 준비한다. 알(卵)의 경우, 난백과난황을 흔들어 섞어 준비하고, 그 외 식품 경우, 근육을 무균적으로 절개하여준비한다. 준비한 시료는 디스크를 6개씩 삽입하여 30～60분간 체액을흡수시킨다. 이후 디스크를 제거하여 6종류의 검사용 평판에 하나씩 올려놓고 가볍게 눌러준 다음 실온에 약 30분간 방치한 뒤 배양시킨다. 각 시험균은 짜내기법과 동일하게 배양한다.
7) 판정
저지환의 직경이 12 mm 이상인 것을 양성으로 판정한다. 양성으로 판정된 시료는 다음표에 따라 항생물질 또는 합성항균제의 계통을 추정할 수 있다.
| B. megaterium (MH) |
G. stearothermo-philus (AM #2) |
B. subtilis (AM #5) |
B. cereus (AM #8) |
K. rhizophila (EEC) |
E. coli (TA) |
추정 물질 계통 |
| ++ |
++ |
+ |
++ |
+ |
+ |
Tetracycline계 |
| ++ |
+ |
++ |
+ |
++ |
－ |
Macrolide계 |
| ++ |
+++ |
－ |
－ |
++ |
+++ |
Penicillin계 |
| +++ |
－ |
+ |
－ |
+ |
+++ |
Aminoglycoside계 |
| ++ |
－ |
－ |
－ |
－ |
－ |
Sulfonamide계 |
| + |
－ |
－ |
+ |
－ |
++ |
Quinolone계 |
| + |
+++ |
－ |
± |
± |
++ |
Cephalosporin계 |
| + |
+ |
－ |
－ |
－ |
－ |
Peptide계 |
| － |
++ |
－ |
+ |
－ |
－ |
Polyether계 |
| + |
++ |
－ |
++ |
+ |
－ |
Novobiocin |
주)+++: 0.1 mg/kg 이하, ++: 0.1∼1 mg/kg, +: 1∼10 mg/kg, －
