1) 시험법 적용범위
 
  
 축산물에 적용한다.
 
  
 2) 분석원리
 
  
 시료중 분석대상물질을포름산암모늄 함유 아세토니트릴:물(4:1, v/v) 혼합용액으로 추출하고C18을 이용한 분산고체상추출법으로 정제하여 액체크로마토그래프/질량분석기로 분석한다.
 
  
 3) 장치
 
  
 액체크로마토그래프/질량분석기(LC-MS/MS)
 
  
 4) 시약 및 시액
 
  
 가) 용매: 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것
 
  
 나) 물: 3차 증류수 또는 이와 동등한 것
 
  
 다) 표준원액: 표준품을 메탄올에 녹여 조제한 용액을 표준원액으로 한다. 조제된 표준원액은 냉동 보관한다.
 
  
 라) 표준용액:각각의 표준원액을 잔류허용기준 또는 검출에 적합한 농도가 되도록 물로 희석하여 사용한다.
 
  
 마) 200 mM포름산암모늄 수용액: 100 mL 용량플라스크에포름산암모늄1.25 g을 넣고 물로표시선까지 채운다.
 
  
 바) 0.1%포름산(formic acid)수용액: 1,000 mL 용량플라스크에포름산1 mL을 넣고 물로 표시선까지 채운다.
 
  
 사)0.1%포름산함유 아세토니트릴: 1,000 mL 용량플라스크에포름산1 mL을 넣고 아세토니트릴로표시선까지 채운다.
 
  
 아) C18충전제: 입자크기 37∼55 μm, 공극크기 125 Å 또는 이와 동등한 것
 
  
 자) 기타시약: 특급 또는 이와 동등한 것
 
  
 5) 시험용액의 조제
 
  
 균질화한시료2 g을 50 mL 원심 분리관에 취하고 200 mM포름산암모늄 수용액0.1 mL과 물 2 mL을 넣어흔들어 섞어 추출한다. 아세토니트릴 8 mL을 넣고 15분간 강하게흔들어 섞어혼합한 후 10,000G에서10분간 원심분리한다. 상층액을 취하여 C18분말 500 mg을 분산시킨 후, 헥산 10 mL을넣고1분간흔들어 섞는다. 10,000G에서 5분간 원심분리하고, 눈금이 표시된 시험관에 하층액 5 mL 취해 옮긴 후,40℃ 이하에서1 mL가되도록 질소 농축한다. 농축액 1 mL 중 0.5 mL을 취하여0.2 μm PVDF (polyvinylidenefluoride) 멤브레인필터로 여과하여 시험용액으로 한다.
 
  
 6) 시험조작
 
  
 가) 액체크로마토그래프 측정조건
 
  
 (1) 컬럼: C18(2.1 mm × 50 mm, 1.7 μm) 또는 이와 동등한 것
 
  
 (2) 이동상
 
  
 (가) 이동상 A: 0.1%포름산수용액
 
  
 (나) 이동상 B: 0.1%포름산함유 아세토니트릴
 
  
 
   
 
    
 
     
 
 시간(분)
 
 
     
 
 이동상 A(%)
 
 
     
 
 이동상 B(%)
 
 
    
 
    
 
     
 
 0.00
 
 
     
 
 90
 
 
     
 
 10
 
 
    
 
    
 
     
 
 0.20
 
 
     
 
 90
 
 
     
 
 10
 
 
    
 
    
 
     
 
 2.50
 
 
     
 
 5
 
 
     
 
 95
 
 
    
 
    
 
     
 
 3.50
 
 
     
 
 5
 
 
     
 
 95
 
 
    
 
    
 
     
 
 3.51
 
 
     
 
 90
 
 
     
 
 10
 
 
    
 
   
 
  
 
  
 (3) 유속: 0.5 mL/분
 
  
 (4)컬럼온도: 40℃
 
  
 (5) 주입량: 5 μL
 
  
 나) 질량분석기 조건
 
  
 (1) Ionizationmode: ESI(Positive, negative)
 
  
 (2) Capillary temperature: 350℃
 
  
 (3) Collision gas: Ar(아르곤)
 
  
 
   
 
    
 
     
 
 연번
 
 
     
 
 물질명
 
 (Compound)
 
 
     
 
 머무름 시간
 
 (분)
 
 
     
 
 이온화 (Ionization mode)
 
 
     
 
 관측질량
 
 (Exact mass)
 
 
     
 
 선구이온
 
 (Precursor ion,m/z)
 
 
     
 
 생성이온
 
 (Product ion,m/z)
 
 
     
 
 충돌에너지
 
 (Collision energy, eV)
 
 
    
 
    
 
     
 
 1
 
 
     
 
 디클로페낙
 
 (Diclofenac)
 
 
     
 
 2.20
 
 
     
 
 Negative
 
 
     
 
 295.0
 
 
     
 
 294.1
 
 
     
 
 250.1
 
 
     
 
 10
 
 
    
 
    
 
     
 
 214.2
 
 
     
 
 20
 
 
    
 
    
 
     
 
 2
 
 
     
 
 멜록시캄
 
 (Meloxicam)
 
 
     
 
 2.02
 
 
     
 
 Negative
 
 
     
 
 351.0
 
 
     
 
 350.0
 
 
     
 
 146.1
 
 
     
 
 20
 
 
    
 
    
 
     
 
 286.1
 
 
     
 
 15
 
 
    
 
    
 
     
 
 3
 
 
     
 
 아세틸 살리실산
 
 (Acetyl salicylic acid)
 
 
     
 
 1.53
 
 
     
 
 Negative
 
 
     
 
 180.0
 
 
     
 
 137.0
 
 
     
 
 93.1
 
 
     
 
 15
 
 
    
 
    
 
     
 
 65.2
 
 
     
 
 30
 
 
    
 
    
 
     
 
 4
 
 
     
 
 카프로펜
 
 (Carprofen)
 
 
     
 
 2.15
 
 
     
 
 Negative
 
 
     
 
 273.1
 
 
     
 
 272.0
 
 
     
 
 228.0
 
 
     
 
 15
 
 
    
 
    
 
     
 
 226.0
 
 
     
 
 30
 
 
    
 
    
 
     
 
 5
 
 
     
 
 케토프로펜
 
 (Ketoprofen)
 
 
     
 
 2.00
 
 
     
 
 Positive
 
 
     
 
 254.1
 
 
     
 
 255.0
 
 
     
 
 209.1
 
 
     
 
 15
 
 
    
 
    
 
     
 
 105.1
 
 
     
 
 25
 
 
    
 
    
 
     
 
 6
 
 
     
 
 톨페남산
 
 (Tolfenamic acid)
 
 
     
 
 2.36
 
 
     
 
 Negative
 
 
     
 
 261.1
 
 
     
 
 260.0
 
 
     
 
 216.1
 
 
     
 
 15
 
 
    
 
    
 
     
 
 35.1
 
 
     
 
 25
 
 
    
 
    
 
     
 
 7
 
 
     
 
 파라세타몰
 
 (Paracetamol)
 
 
     
 
 0.56
 
 
     
 
 Positive
 
 
     
 
 151.1
 
 
     
 
 152.0
 
 
     
 
 110.1
 
 
     
 
 20
 
 
    
 
    
 
     
 
 65.1
 
 
     
 
 30
 
 
    
 
    
 
     
 
 8
 
 
     
 
 페닐부타존
 
 (Phenylbutazone)
 
 
     
 
 2.27
 
 
     
 
 Negative
 
 
     
 
 308.2
 
 
     
 
 307.1
 
 
     
 
 131.1
 
 
     
 
 25
 
 
    
 
    
 
     
 
 279.2
 
 
     
 
 20
 
 
    
 
    
 
     
 
 9
 
 
     
 
 플루닉신
 
 (Flunixin)
 
 
     
 
 2.05
 
 
     
 
 Negative
 
 
     
 
 296.1
 
 
     
 
 295.0
 
 
     
 
 251.1
 
 
     
 
 15
 
 
    
 
    
 
     
 
 209.1
 
 
     
 
 30
 
 
    
 
   
 
  
 (4) 분석대상물질의 개별 조건
  
 
  
 ※ 밑줄 표시 되어 있는 것은 정량이온이며 그 외 이온들은 정성이온임
 
  
 7) 정성 및 확인시험
 
  
 가) 정성 및 확인
 
  
 위의 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크는 표준용액 피크의 머무름 시간과 비교하여일치하여야 한다. 또한 표준용액과 시험용액의 선구이온(precursor ion) 및 생성이온(product ion)이 일치하여야 하고,표준용액과 시험용액의 생성이온간 반응세기의 비율(ion ratio)을 비교하여 그 비율은 주1)과 일치하여야 한다. 확인시험의 경우, 음성시료
 (blank sample)에 해당 물질을 넣은 것을 시료와 동일하게 전처리하여 얻은 표준용액 으로서 비교한다.
 
  
 주1)생성이온간 반응세기의 비율 허용범위
 
  
 
   
 
    
 
     
 
 이온간 반응세기의 비율
 
 (Base peak에 대한 %)
 
 
     
 
 허용범위
 
 
    
 
    
 
     
 
 > 50%
 
 
     
 
 ± 20%
 
 
    
 
    
 
     
 
 > 20%, ≤ 50%
 
 
     
 
 ± 25%
 
 
    
 
    
 
     
 
 > 10%, ≤ 20%
 
 
     
 
 ± 30%
 
 
    
 
   
 
  
 
  
 나) 표준품 크로마토그램
 
  
 
 
  
 그림 1. 비스테로이드성 항염증제 표준품의 크로마토그램(0.1 mg/kg)
 
  
 8) 정량시험
 
  
 가) 정성시험에서 검출된 잔류동물용의약품은 식품공전 8.3의 정량시험법을 따른다.
 
  
 나) 8.3 정량시험법에 해당물질의 시험법이 없을 경우,조직표준곡선(tissue standard curve) 작성을 위하여 각 해당 물질이 검출되지 않은 음성시료(blank sample) 2 g씩 준비한 후, 음성시료(blank sample)를 포함하여 5개 이상의 농도로 전처리하여 표준용액을 제조한다. 각 농도별 첨가시료에서 얻어진 크로마토그램상의 각 피크 높이 또는 면적을 구하여 검량선을 작성한 후 시험용액의 크로마토그램으로부터 정량이온(quantitative ion)의 각 피크 높이 또는 피크 면적에 따라 산출된 시험용액 중 검출농도, 시료량과 최종 시험용액의 부피를 고려하여 정량한다.