9.2.5 푸모니신(Fumonisin)
 
  
가. 시험법의 적용범위 : 옥수수 및 옥수수가공식품
 
  
나. 분석원리검체 중의 푸모니신을 메탄올․아세토니트릴․물(25:25:50, v/v/v) 혼합용액으로 추출, 여과한 것을 면역친화성컬럼으로 정제시키고 OPA(ο-phthaldialdehyde) 시액으로 유도체화한 후 형광검출기가 부착된 액체크로마토그래프로 분석한다.
 
  
다. 장치
 
  
1) 액체크로마토그래프 : 형광검출기(Fluorescence detector)를 사용한다. 
 
 
  
2) 정제용 컬럼 : 푸모니신용 면역친화성칼럼(Immunoaffinity column) (회수율 및 재현성 등이 검증된 것) 
 
 
  
3) 여과지：Whatman No.2(12.0 cm) 또는 이와 동등한 것 
 
 
  
4) 유리섬유여과지(glass fiber filter) : Whatman GF/A pore size : 1.6 μm) 또는 이와 동등한 것 
 
 
  
라. 시약 및 시액
 
  
1) 용매 : 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것 
 
 
  
2) 물 : 3차 증류수 또는 이와 동등한 것 
 
 
  
3) 푸모니신 혼합표준원액 : 푸모니신 B 
 1및 B2를 아세토니트릴․물(50:50, v/v) 혼합용액에 녹여 각각 200 μg/mL가 되도록 한다. 
 
  
4) 푸모니신 혼합표준용액 : 푸모니신 혼합표준용액 1 mL를 정확히 취하여 아세토니트릴․물(50:50, v/v) 혼합용액으로 정확히 100 mL로 한다. 
 
 
  
5) 추출용액 
 
 
  
메탄올․아세토니트릴․물(25 : 25 : 50, v/v/v)
 
  
6)OPA(ο-phthaldialdehyde) 시액 
 
 
  
ο-phthaldialdehyde 40 mg을 1 mL 메탄올에 녹인 것을 0.1 M Na2B4O7용액 5 mL로 희석하고 메르캅토에탄올(2-mercaptoethanol) 50 μL를 가하여 혼합한다. 이 시액은 갈색 바이알(Vial)에 넣어 어두운 곳에서 1주간 실온보관 가능하다.
 
  
7) PBS(Phosphate-buffered saline) 용액 
 
 
  
염화나트륨(NaCl) 8.0 g, 무수 제이인산나트륨(Na2HPO4) 1.2 g, 제일인산칼륨(KH 
 2PO4) 0.2 g 및 염화칼륨(KCl) 0.2 g을 물 990 mL에 녹인 것을 2 M 염산으로 pH 7.0으로 조정한 후 물로 1 L로 한다. 
 
  
8) 0.1 M 제일인산나트륨(NaH 
 2PO4․2H2O) 용액 : 제일인산나트륨(NaH 2PO4․2H2O) 15.6 g를 물 990 mL에 녹인 것을 인산(H 3PO4)을 사용하여 pH 3.3으로 조정한 후 물로 1 L로 한다. 
 
  
마. 시험용액의 조제
 
  
1) 추출 
 검체를 분쇄하여 균질화한 시료 20 g을 정밀히 달아 추출용액 100 mL를 넣어 5분간 고속으로 균질화한 후 이를 여과지로 여과한다. 여액 10 mL를 100 mL 플라스크에 취하고 PBS 용액 40 mL로 희석시킨다. 희석액을 흔들어 섞은 후 유리섬유여과지(glass fiber filter)로 여과한 것을 추출액으로 한다. 
 
  
2) 정제 
 추출액 10 mL를 인산으로 pH 6.8 ～ 7.2로 조정한 후 정제용 컬럼에 주입하여 초당 1～2 방울의 속도로 통과시킨다. 이어서 PBS 용액 10 mL을 같은 유속으로 유출하여 버린 후 메탄올․물(80:20, v/v) 혼합용액 4 mL로 용출시킨다. 
 
  
3) 유도체화 
 
 
  
용출액을 약 60℃에서 질소로 건고시킨 후 잔류물에 아세토니트릴․물(50:50, v/v) 혼합용액 200 μL을 가하여 녹이고 이 중 50 μL를 취하여 OPA 시액 50 μL과 섞고 30초간 교반한 것을 시험용액으로 한다.
 
  
[주의사항] OPA-푸모니신 유도체는 반응 후 시간이 경과함에 따라 형광성이 떨어지므로 신속하게 액체크로마토그래프에 주입하여야 한다.
 
  
바. 시험조작
 
  
1) 액체크로마토그래프의 측정조건 
 
 
  
가) 칼럼 : C18(4.6 × 250 mm, 5 μm) 또는 이와 동등한 것
 
  
나) 이동상 : 메탄올․0.1 M 제일인산나트륨(NaH2PO4) 용액(77 : 23, v/v), 인산을 사용하여 pH 3.3으로 조정 
 
 
  
다) 검출파장
 
  
- 여기파장 : 335 nm
 
  
- 형광파장 : 440 nm
 
  
라) 유속 : 1 mL/분
 
  
마) 주입량 : 5～20 μL
 
  
2) 검량선 작성 
 
 
  
푸모니신 혼합표준용액을 아세토니트릴․물(50:50, v/v) 혼합용액으로 희석하여 0.1, 0.5, 1.0, 2.0 μg/mL가 되도록 하고 각각 1 mL을 취하여 60℃에서 질소로 건고한 후 앞의 마. 시험용액의 조제 3) 유도체화에 따라 조작하여 검량선을 작성한다.
 
  
3) 정성시험 
 
 
  
위 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크는 표준용액 피크의 머무름 시간과 일치하여야 한다.
 
  
4) 정량시험 
 
 
  
정성시험과 동일한 조건에서 얻어진 시험용액의 크로마토그램으로부터 푸모니신의 피크높이 또는 피크면적을 검량선에 대입하여 정량한다.
 
  
사. 계산
 
  
푸모니신의 함량(mg/kg) = (CFB1+ CFB2) × 50/g 
 
 
  
CFB1: 검량선에서 구한 푸모니신 B1의 농도(μg/mL)
 
  
CFB2: 검량선에서 구한 푸모니신 B2의 농도(μg/mL)
 
  
50 : 희석배수
 
  
g : 시료 채취량(g)