- ▶ 제 8. 일반시험법 ▶ 9. 식품 중 유해물질 시험법 ▶ 9.3 다이옥신 ▶ 9.3.2 고분해능 기체크로마토그래프/고분해능 질량분석기(HRGC/HRMS)에 의한 시험
9.3.2 기체크로마토그래프/고분해능 질량분석기(GC/HRMS)에 의한 시험
가. 시험법 적용범위
식육(소고기, 돼지고기, 닭고기)
나. 분석원리
검체 중의 4∼8염화 dibenzo-p-dioxin(CDDs) 및 dibenzofuran(CDFs)를 측정하기 위해 전처리과정을 통하여 지방을 추출하고 칼럼크로마토그래프로 정제한 것을 기체크로마토그래프/고분해능 질량분석기(GC/HRMS)로 분석한다.
다. 장치
기체크로마토그래프/고분해능 질량분석기(GC/HRMS) : 분해능 10,000 이상을 사용한다.
라. 시약 및 시액
시약 및 시액은 다이옥신 분석에 영향을 미치는 방해성분을 함유하지 않아야 한다.
1) 용매：잔류농약 분석용 또는 이와 동등 이상인 것.
2) 검량용 표준물질(Calibration standard)：다이옥신의 정성 및 정량에 사용하는 검량용 표준물질은 표 1과 같이 2,3,7,8-치환 동족체 17종과
13C12동족체(Labeled) 및 37Cl4동족체를 사용한다.3) 회수율 측정용 표준물질(Labeled compound standard)：시료의 추출과정 전에 첨가하는 정량 및 회수율 측정용 내부표준물질은
13C12동족체로 된 다이옥신 중 표 1과 같은 화합물을 사용한다.4) 내부표준물질(Internal standard solution)：기체크로마토그래프/고분해능 질량분석기에 주입하기 전에 첨가하는 내부표준물질은
13C12-1,2,3,4-TCDD 및13C12-1,2,3,7,8,9-HxCDD를 사용한다.5) 검량선 작성용 표준물질의 조제：정량용 표준물질을 검출한계 부분의 저농도의 것과 예상 검출농도보다 높은 고농도의 것을 적어도 하나 이상 포함시켜 5단계 이상의 농도 범위로 조제한다.
단, 검량선 작성용 표준용액들은 직선성을 유지하여야 한다. 검량선 작성용 표준용액은 정량용 표준물질의13C12동족체 및37Cl4동족체가 동일 농도로 함유되어야 한다.
6) 정밀 회수용 표준물질(Precision and recovery standard)：다이옥신의 회수율을 측정하기 위해 일정농도의 정밀 회수용 표준물질을 사용하여야 한다(표 1).
7) 실리카겔：칼럼크로마토그래피용 실리카겔(100～200 mesh)을 디클로로메탄으로 세척하여 180℃에서 1시간 이상 가열한 후 데시케이터에서 식힌다.
8)산성 실리카겔(30%, w/w)：실리카겔 100 g에 황산 44.0 g을 넣어 잘 흔들어 섞어 사용한다.
9) 염기성 실리카겔：실리카겔 100 g에 1 N 수산화나트륨 30 g을 넣어 잘 흔들어 섞어 사용한다.
10) 염기성 알루미나：600℃에서 24시간 이상 가열한 후 데시케이터에서 식힌다.
11) 실리카겔 칼럼：안지름 11 mm, 길이 177 mm의 정제용 칼럼(중성실리카겔 1.5 g, 염기성실리카겔 2 g, 산성실리카겔 4 g의 순서로 충전한 것) 또는 이와 동등 이상의 것.
12) 알루미나 칼럼：안지름 11 mm, 길이 177 mm의 정제용 칼럼(염기성알루미나 12.5 g을 충전한 것) 또는 이와 동등 이상의 것.
13) 카본 칼럼：안지름 11 mm, 길이 10 mm의 정제용 칼럼[8% 카본/규조토(celite 545-AW 0.275 g을 충전한
것)] 또는 이와 동등 이상의 것.14) 무수황산나트륨：특급이상(400℃에서 최소 1시간 이상 구운 것)
15) 1 N 수산화나트륨：수산화나트륨 45.0 g을 취하여 물로 1 L로 한 것을 사용한다.
16) 기타：다이옥신 분석에 적합한 것
마. 시험용액의 조제
1) 추출
검체를 분쇄하여 균질화한 시료 약 15～20 g을 막자사발에 취하여 적당량의 무수황산나트륨을 가하여 수분을 제거한 다음 속슬렛 추출장치용 원통여과지로 옮기고 따로 시료를 넣지 않은 원통여과지에 각각 회수율 측정용 표준물질을 첨가 한 다음 *비등석이 첨가된 속슬렛 추출장치에 추출용매(예: 클로로메탄․헥산 = 3:1, v/v) 300 mL를 넣어 18시간 이상 추출한다. 별도로 회수율 측정용 시료에는 정밀 회수용 표준물질을 첨가하여 *이후부터 동일한 방법을 사용한다.2) 조지방 함량
속슬렛 추출장치의 추출액을 40℃ 이하의 수욕상에서 감압 농축한 후 질소농축기를 이용하여 항량이 될 때까지 농축하여 조지방 함량을 구한다.
| 조지방 함량(g) |
= |
W1- W0 |
| S |
| W0 |
：플라스크의 무게(g) |
| W1 |
：조지방을 추출하여 농축한 플라스크의 무게(g) |
| S |
：시료의 채취량(g) |
3) 조지방 제거
유리솜이 들어있는 분액깔때기에 유리깔때기를 이용하여 무수황산나트륨 20 g과 조지방 1 g 당 산성실리카겔 10 g을 첨가한다. 헥산 3 mL로 조지방을 충분히 용해한 다음 분액깔때기에 묻지 않도록 산성실리카겔 표면에 넓게 뿌려서 넣는다. 이러한 조작을 2회 반복한 다음 20분간 반응시킨 후 헥산 130～150 mL로 용출한다. 이 용출액을 40℃ 이하의 수욕상에서 약 3 mL가 되도록 감압 농축한 후 다른 시험관에 옮기고 감압용기를 다시 헥산 3 mL씩 2회 세척하여 용액을 시험관에 합한다.
4) 정제
위의 용액을 헥산으로 활성화된 실리카겔 칼럼에 넣은 후 헥산으로 용출시키고 그 용출액을 알루미나 칼럼에 첨가한 다음 2% 디클로로메탄 함유 헥산으로 방해물질을 제거하여 50% 디클로로메탄 함유 헥산으로 다시 용출시킨다. 이 알루미나 칼럼에서 용출한 액을 카본 칼럼에 넣고 50% 에틸아세테이트 함유 벤젠으로 용출시킨 다음 다시 헥산으로 방해물질을 제거한 후 톨루엔으로 역 용출한다. 이 용출액을 질소 농축기를 사용하여 농축한 다음 내부표준물질을 첨가하여 이를 시험용액으로 한다.
주1) 칼럼크로마토그래피에서 사용하는 충전제나 용매의 종류 및 양은 표준물질 등으로 분획 실험하여 최적조건을 확립하여야 한다.
바. 시험조작
1) 기체크로마토그래프의 측정조건
가) 칼럼：DB-5 캐필러리 칼럼(길이 60 m, 안지름 0.2～0.32 mm, 두께 0.1～0.25 μm) 또는 이와 등등 이상의 것으로 분석하고자 하는 전 동족체가 양호하게 분리되어야 하며 그 분리 효율을 입증할 수 있는 것이어야 한다.
나) 오븐온도：각 동족체의 분리가 양호하도록 적절한 온도조건을 설정한다.
단, 2,3,7,8-TCDD와 2,3,7,8-TCDF는 인접한 피크의 분리도가 봉우리 높이 대비 25% 미만이어야 한다.
다) 운반기체(carrier gas) 및유량：헬륨, 0.5～5.0 mL/분
라) 주입부 온도：약 270℃ 또는 각 동족체의 분리가 양호한 온도
마) 연결부 온도：약 290℃ 또는 각 동족체의 분리가 양호한 온도
바) 이온원 온도：약 260℃ 또는 각 동족체의 분리가 양호한 온도
2) 고분해능 질량분석기의 측정조건
가) 튜닝 표준물질：PFK(perfluorkerosene) 또는 이와 동등한 것
나) 분해능：10,000 이상 (10% valley 기준)
다) 이온화방식：전자충격이온화 방식 (EI)
라) 질량 설정：측정하고자 하는 이온의 질량은 각 동족체마다 2개 이상의 이온을 선택이온(selected ion), 즉 M+, [M+2]+또는 [M+4]+를 사용한다. 주로 사용하는 각 다이옥신 동족체의 대표적 이온 질량은 표 1과 같다.
마) 질량 검정：기체크로마토그래프/고분해능 질량분석기는 시료 분석조건과 동일한 조건에서 분해능 10,000 이상으로 조정한 다음, 4 염화물에서 8 염화물의 선택이온들을 적당한 그룹으로 나누어 튜닝 표준물질에 의한 질량 검정을 하여야 한다.
바) 주기적 점검：분석을 지속적으로 수행하는 경우 매 12시간마다 검량용 표준물질 중 중간농도의 표준물질을 선택하여 분석조건을 점검하여야 하며 회수율은 80%～120%에 있어야 한다.
사) 검출한계：4, 5염화물 각각의 검출한계는 0.04 pg/g이하이어야 한다.
3) 검량선 작성
검량선 작성용 표준물질을 사. 정성시험과 같은 방법으로 기체크로마토그래프/고분해능 질량분석기에 주입하여 각 선택이온에 대한 크로마토그램을 작성하여 각 표준물질의 피크 면적과 이에 대응하는 13C12동족체의 피크 면적으로부터 다음 식에 의해 상대감응도(Relative Response：RR)를 구한다. 상대감응도는 5개 농도 이상의 검량선 작성용 표준물질을 사용하며 편차범위는 ±20% 이내이어야 한다.
| RR |
= |
(A1n+ A2n)(Cl) |
| (A1l+ A2l)(Cn) |
| A1n, A2n |
：검량선 작성용 표준물질에 첨가된 다이옥신의 1차 또는2차 선택 이온의 피크 면적 |
| A1l, A2l |
：검량선 작성용 표준물질에 첨가된13C12동족체의 1차 또는 2차 선택 이온의 피크 면적 |
| Cn |
：검량선 작성용 표준물질의 농도 |
| Cl |
：검량선 작성용 표준물질에 첨가된13C12동족체의 농도 |
4) 감응계수(Response Factor)
감응계수(RF)는 검량선 작성용 표준물질로부터 얻은 크로마토그램으로 내부 표준법에 따라 다음의 식으로부터 구한다. 5개 농도의 검량선 작성용 표준물질을 사용한 감응계수의 편차범위는 ±35% 이내이어야 한다.
| RF |
= |
(A1s+ A2s)(Cis) |
| (A1is+ A2is)(Cs) |
| A1s, A2s |
：검량선 작성용 표준물질의 1차 또는 2차 선택이온의 피크 면적 |
| A1is, A2is |
：검량선 작성용 표준물질에 첨가된 회수율 측정용 표준물질의 1차 또는 2차 선택이온의 피크 면적 |
| Cs |
：검량선작성용 표준물질의 농도 |
| Cis |
：검량선 작성용 표준물질에 첨가된 회수율 측정용 내부표준물질의 농도 |
5) 회수율 측정용 표준물질의 농도 및 회수율
시료에 첨가된 회수율 측정용 표준물질의 농도(C l) 및 회수율은 다음 식에 의해 구한다.
| Cl(ng/g) |
= |
(A1s+ A2s)(Cis) |
| (A1is+A2is) × RF |
| 회수율(%) |
= |
Cl(ng/g) |
× 100 |
| Cspk(ng/g) |
| A1s, A2s |
：회수율 측정용 표준물질(13C12동족체)의 1차 또는 2차 선택이온의 피크 면적 |
| A1is, A2is |
：내부표준물질의 1차 또는 2차 선택이온의 피크 면적 |
| Cis |
：내부표준물질의 농도 |
| RF |
：반응계수 |
| Cl |
：검량선 작성용 표준물질에 첨가된13C12동족체의 농도 |
| Cspk |
：첨가한 회수율 측정용 표준물질의 농도 |
사. 정성시험위의 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크는 어떠한 측정조건에서도 표준용액 피크의 머무름 시간과 일치하여야 하며, 측정한 선택이온 2개의 이온세기 비율은 표 2～3에 나타난 이론값에 대하여 ±15% 이내이어야 한다. 단, 모든 신호 대 잡음(S/N)비는 2.5 보다 커야 하며, 정량용13C12및37Cl4의 경우는 10보다 커야 한다.
아. 정량시험정성시험과 동일한 조건에서 얻어진 시험결과에 의해 검출된 각각의 다이옥신에 대해 이에 대응하는 검량용13C12동족체 및37Cl4동족체 표준물질로 상대 내부표준법으로 정량한다. 또한 회수율 측정용 표준물질37Cl4-2,3,7,8-TCDD와13C12-2,3,7,8-TCDD 등 15종의 표준물질에 대한 농도를 절대 내부표준법으로 정량한다. 회수율 측정용 표준물질의 회수율은 17% 이상 185% 이하이어야 하며, 정밀 회수용 표준물질의 회수율은 63% 이상 170% 이하이어야 한다.
1) 다이옥신 농도의 계산
시료 중 다이옥신 농도는 다음 식으로부터 구한다.
| 다이옥신 농도 (pg/g fat) |
= |
(A1n+ A2n)(Cl) |
× |
Vex |
× |
1,000 |
| (A1l+ A2l)(RR) |
Ws |
| A1n, A2n |
：시료에 함유된 대상물질의 1차 또는 2차 선택이온의 피크 면적 |
| A1l, A2l |
：A1n와 A2n에 대응하는시료에 첨가된13C12동족체 화합물의 1차 또는 2차 선택 이온의 피크 면적 |
| Cl |
：시료에 첨가된13C12동족체 표준물질의 농도(pg/mL) |
| RR |
：상대감응도 |
| Vex |
：추출량(mL) |
| Ws |
：조지방 함량(g) |
2) 독성등가량(Toxic Equivalents：TEQ)으로 환산
산출한 다이옥신 농도(ng/g fat)의 독성등가량 환산은 각 분석 대상 동족체에 표 4에 해당하는 독성등가계수(Toxic Equivalency Factors : TEFs)를 곱하여 이 합계를 독성등가량(pgTEQ/g fat)으로 한다.
표 1. 대상물질
| PCDDs |
대표적 이온 질량 |
PCDFs |
대표적 이온 질량 |
|
| 2,3,7,8- 1,2,3,7,8- 1,2,3,4,7,8- 1,2,3,6,7,8- 1,2,3,7,8,9- 1,2,3,4,6,7,8- 1,2,3,4,6,7,8,9- |
TCDD PeCDD HxCDD HxCDD HxCDD HpCDD OCDD |
319.8965/321.8936 355.8546/357.8517 389.8157/391.8127 389.8157/391.8127 389.8157/391.8127 423.7767/425.7737 457.7377/459.7348 |
2,3,7,8-TCDF 1,2,3,7,8-PeCDF 2,3,4,7,8-PeCDF 1,2,3,4,7,8-HxCDF 1,2,3,6,7,8-HxCDF 1,2,3,7,8,9-HxCDF 2,3,4,6,7,8-HxCDF 1,2,3,4,6,7,8-HpCDF 1,2,3,4,7,8,9-HpCDF 1,2,3,4,6,7,8,9-OCDF |
303.9016/305.8987 339.8597/341.8568 339.8597/341.8568 373.8207/375.8178 373.8207/375.8178 373.8207/375.8178 373.8207/375.8178 407.7818/409.7788 407.7818/409.7788 441.7428/443.7398 |
주2) 약어의 펼친 이름은 다음과 같음.
| PCDD |
= Polychlorodibenzo-p-dioxin |
| PCDF |
= Polychlorodibenzofuran |
| TCDD |
= Tetrachlorodibenzo-p-dioxin |
| TCDF |
= Tetrachlorodibenzofuran |
| PeCDD |
= Pentachlorodibenzo-p-dioxin |
| PeCDF |
= Pentachlorodibenzofuran |
| HxCDD |
= Hexachlorodibenzo-p-dioxin |
| HxCDF |
= Hexachlorodibenzofuran |
| HpCDD |
= Heptachlorodibenzo-p-dioxin |
| HpCDF |
= Heptachlorodibenzofuran |
| OCDD |
= Octachlorodibenzo-p-dioxin |
| OCDF |
= Octachlorodibenzofuran |
표 2. 염소 원자수에 의한 동족체 피크의 자연 존재비
| 자연 존재비 |
||||||||
| M |
M+2 |
M+4 |
M+6 |
M+8 |
M+10 |
M+12 |
M+14 |
|
| 4 |
76.5 |
100 |
48.7 |
10.5 |
0.9 |
|||
| 5 |
61.5 |
100 |
65.0 |
21.1 |
3.5 |
0.2 |
||
| 6 |
51.2 |
100 |
81.2 |
35.2 |
8.5 |
1.1 |
0.06 |
|
| 7 |
43.2 |
100 |
97.5 |
52.8 |
17.1 |
3.3 |
0.36 |
0.02 |
| 8 |
33.8 |
87.9 |
100.0 |
65.0 |
26.4 |
6.8 |
1.1 |
0.10 |
표 3. 염소원자에 따른 선택 이온의 이론적인 이론비
| 염소원자의 수 |
전하대 질량(m/z) 생성비 |
이론비 |
이론범위 |
|
| 최소 |
최대 |
|||
| 4개1) |
M/(M+2) |
0.77 |
0.65 |
0.89 |
| 5개 |
(M+2)/(M+4) |
1.55 |
1.32 |
1.78 |
| 6개 |
(M+2)/(M+4) |
1.24 |
1.05 |
1.43 |
| 6개2) |
M/(M+2) |
0.51 |
0.43 |
0.59 |
| 7개 |
(M+2)/(M+4) |
1.05 |
0.88 |
1.20 |
| 7개3) |
M/(M+2) |
0.44 |
0.37 |
0.51 |
| 8개 |
(M+2)/(M+4) |
0.89 |
0.76 |
1.02 |
1)：37Cl4-2,3,7,8-TCDD 제외
2)：13C12-HxCDF에만 적용
3)：13C12-HpCDF에만 적용
표 4. 독성등가계수(Toxic Equivalency Factors; WHO 2005 TEFs)
| 다이옥신 |
WHO - TEF |
||
| 2,3,7,8-TCDD 2,3,7,8-TCDF 1,2,3,7,8-PeCDD 1,2,3,7,8-PeCDF 2,3,4,7,8-PeCDF 1,2,3,4,7,8-HxCDD 1,2,3,6,7,8-HxCDD 1,2,3,7,8,9-HxCDD 1,2,3,4,7,8-HxCDF 1,2,3,6,7,8-HxCDF 1,2,3,7,8,9-HxCDF 2,3,4,6,7,8-HxCDF 1,2,3,4,6,7,8-HpCDD 1,2,3,4,6,7,8-HpCDF 1,2,3,4,7,8,9-HpCDF OCDD OCDF |
1 0. 1 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0. |
1 03 3 1 1 1 1 1 1 1 01 01 01 0003 0003 |
|
