- ▶ 제 8. 일반시험법 ▶ 9. 식품 중 유해물질 시험법 ▶ 9.4 폴리염화비페닐(PCBs) ▶ 9.4.2 기체크로마토그래프/질량분석기에 의한 시험
9.4.2 기체크로마토그래프/질량분석기에 의한 시험
가. 시험법 적용범위어류중의 폴리염화비페닐 7종 정량에 적용한다.
나. 분석원리어류의 가식부를 취하여 속슬렛 추출장치에 넣고 조지방을 추출한 후 추출용액을 농축하고 다층 실리카겔 칼럼으로 정제하여 기체크로마토그래프/질량분석기로폴리염화비페닐 7종을분석한다.
다. 장치기체크로마토그래프/질량분석기를 사용한다.
라. 시약 및 시액
1) 용매：잔류농약 분석용 또는 이와 동등 이상인 것.
2) 무수황산나트륨：특급이상(400℃에서 최소 1시간 이상 구운 것)
3) 다층 실리카겔 칼럼：안지름 25 mm, 길이 550 mm의 정제용 칼럼에 <그림 1>와 같이 아래부터 무수황산나트륨 1 g, 중성실리카겔 1 g, 염기성실리카겔 3 g, 중성실리카겔 1 g, 산성실리카겔 5 g, 중성실리카겔 2 g, 무수황산나트륨 2 g의 순서로 충전한 것 (또는 이와 동등 이상의 것)
|
|
|
| 무수황산나트륨2 g |
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| 중성실리카겔2 g |
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| 산성실리카겔5 g |
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| 중성실리카겔1 g |
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| 염기성실리카겔3 g |
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| 중성실리카겔1 g |
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| 무수황산나트륨1 g |
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| 그림 1.다층 실리카겔 칼럼 |
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4) 중성 실리카겔：칼럼크로마토그래피용 실리카겔(100～200 mesh)을 유리칼럼에 채우고 메탄올, 헥산과 디클로로메탄으로 순으로 용리 세척하여 180℃에서 8시간 이상 가열한 후 데시케이터에서 방냉한다.
5) 산성 실리카겔(30%, g/g)：중성 실리카겔 100 g에 진한 황산 44.0 g를 넣고 균일하게 혼합한다.
6) 염기성 실리카겔(23%, g/g)：중성 실리카겔 100 g에 1N 수산화나트륨 30.0 g를 넣고 균일하게 혼합한다.
7) 추출용매 : 디클로로메탄:헥산(3：1, v/v)
※ 사용되는 시약 및 시액은 폴리염화비페닐 분석에 영향을 미치는 방해성분을 함유하지 않아야 하며, 차광용기를 사용한다.
8) 표준원액：폴리염화비페닐 7종 표준품을 노난에 녹여 1000 ㎍/mL 가 되게 한다<표 1>.
표 1. 분석대상 폴리염화비페닐(indicator PCBs 7종)의 표준물질
| 동족체 |
BZ 번호* |
|
| 3염화비페닐 |
2,4,4'-trichlorobiphenyl |
28 |
| 4염화비페닐 |
2,2',5,5'-tetrachlorobiphenyl |
52 |
| 5염화비페닐 |
2,2',4,5,5'-pentachlorobiphenyl |
101 |
| 2,3',4,4',5-pentachlorobiphenyl |
118 |
|
| 6염화비페닐 |
2,2',3,4,4',5'-hexachlorobiphenyl |
138 |
| 2,2',4,4',5,5'-hexachlorobiphenyl |
153 |
|
| 7염화비페닐 |
2,2',3,4,4',5,5'-heptachlorobiphenyl |
180 |
* Ballschmiter and Zell 번호: PCBs의 각 페닐 고리의 염소 위치를 나타낸 번호
9) 내부표준원액：
13C12동족체로 된 폴리염화비페닐 7종의 내부 표준품을 노난에 녹여 50 ㎍/mL 가 되게 한다.
10) 검량선 작성용 표준용액：표준원액과 내부표준원액에 노난을 가해 <표 2>와 같이 표준용액 5단계 이상의 농도 범위(0.01 ～ 0.5 ㎍/mL)로 조제한 것을 사용한다. 단, 검량선 작성용 표준용액들은 직선성을 유지하여야 한다.
표 2. 폴리염화비페닐의 검량선 작성용 표준용액
(단위 : ㎍/mL)
| 표준액 |
BZ 번호 |
CS* 0.01 |
CS 0.05 |
CS 0.1 |
CS 0.2 |
CS 0.5 |
| 3염화 비페닐 |
28 |
0.01 |
0.05 |
0.1 |
0.2 |
0.5 |
| 28L* |
0.1 |
0.1 |
0.1 |
0.1 |
0.1 |
|
| 4염화 비페닐 |
52 |
0.01 |
0.05 |
0.1 |
0.2 |
0.5 |
| 52L* |
0.1 |
0.1 |
0.1 |
0.1 |
0.1 |
|
| 5염화 비페닐 |
101 |
0.01 |
0.05 |
0.1 |
0.2 |
0.5 |
| 118 |
0.1 |
0.1 |
0.1 |
0.1 |
0.1 |
|
| 101L* |
0.01 |
0.05 |
0.1 |
0.2 |
0.5 |
|
| 118L* |
0.1 |
0.1 |
0.1 |
0.1 |
0.1 |
|
| 6염화 비페닐 |
138 |
0.01 |
0.05 |
0.1 |
0.2 |
0.5 |
| 153 |
0.1 |
0.1 |
0.1 |
0.1 |
0.1 |
|
| 138L* |
0.01 |
0.05 |
0.1 |
0.2 |
0.5 |
|
| 153L* |
0.1 |
0.1 |
0.1 |
0.1 |
0.1 |
|
| 7염화 비페닐 |
180 |
0.01 |
0.05 |
0.1 |
0.2 |
0.5 |
| 180L* |
0.1 |
0.1 |
0.1 |
0.1 |
0.1 |
※ CS* : 검량선 작성용 표준용액 (Calibration Standard Solution)
※ L* : 동위원소로 치환된(Labeled Compound,13C12) 내부표준물질
마. 시험용액의 조제
1) 조지방 추출
어류 가식부의 균질화된 시료 약 10 g을 막자사발에 취한다. 무수황산나트륨을 가하여 막자로 저어 수분을 제거한 다음 속슬렛 추출장치용 원통형 여지로 옮긴다. 따로 시료를 넣지 않은 무수황산나트륨을 대조시료로 하여 속슬렛 추출장치용 원통형 여지에 넣고, 각각 동일한 농도의 내부표준첨가용액을 첨가 한 다음 속슬렛 추출장치를 이용하여 추출용매 300 mL로 18～24 시간 동안 시간당 3～4번의 환류속도로 추출한다. 추출액을 35℃ 이하의 수욕상에서 10 mL까지 감압 농축 한 후 질소농축기를 이용하여 농축한다.
2) 정제
유리솜이 들어있는 분액깔때기에 유리깔때기를 이용하여 무수황산나트륨 20 g을 넣은 다음 산성실리카겔 30 g을 넣어준다. 농축된 조지방을 헥산 3 mL로 용해한 다음 분액깔때기에 묻지 않도록 산성실리카겔 표면에 넓게 뿌려서 넣는다. 이러한 조작을 2회 반복한 다음 20분간 정치시킨 후 헥산 150 mL로 용출한다. 따로 미리 제조된 다층 실리카겔 칼럼을 헥산 100 mL로 활성화시킨 후 앞의 용출액을 가하고 헥산 200 mL로 용출한다. 이 용출액을 회전감압농축장치로 5 mL까지 농축하고 질소 농축기로 농축한 다음 최종 부피가 1 mL되도록 하여 이를 시험용액으로 한다.
바. 시험조작
1) 기체크로마토그래프의 조건
가) 칼럼：DB-1 (60 m, 0.25 mm I.D., 0.25 μm) 또는 이와 등등 이상의 것
나) 주입부온도：280℃
다) 오븐온도：초기 온도 100℃에서 15℃/분의 비율로 200℃까지 온도를 상승시켜 3분간 유지하고 2℃/분의 비율로 250℃까지 상승시켜 5분간 유지한 다음 5℃/분의 비율로 300℃까지 상승시켜 3분간 유지한다.
라) 운반기체(carrier gas) 및 유량：헬륨(1.0 mL/분)
마) 주입방법 : splitless
바) 주 입 량 : 1.0 uL
2) 질량분석기의 조건
가) 이온화방법： EI
나) 이온화전압 : 70 eV
다) 특성이온 : <표 3> 참조
| 동족체 |
BZ 번호 |
특성이온 |
이론비 (M+/(M+2)+또는 (M+2)+/(M+4)+ |
||
| M+ |
(M+2)+ |
(M+4)+ |
|||
| 3염화비페닐 |
28 |
256.0 |
258.0 |
1.02 |
|
| 28L* |
268.0 |
270.0 |
|||
| 4염화비페닐 |
52 |
289.9 |
291.9 |
0.77 |
|
| 52L* |
301.9 |
303.9 |
|||
| 5염화비페닐 |
101 |
325.9 |
327.9 |
1.53 |
|
| 118 |
325.9 |
327.9 |
|||
| 101L* |
337.9 |
339.9 |
|||
| 118L* |
337.9 |
339.9 |
|||
| 6염화비페닐 |
138 |
359.8 |
361.8 |
1.23 |
|
| 153 |
359.8 |
361.8 |
|||
| 138L* |
371.8 |
373.8 |
|||
| 153L* |
371.8 |
373.8 |
|||
| 7염화비페닐 |
180 |
393.8 |
395.8 |
1.02 |
|
| 180L* |
405.8 |
407.8 |
|||
※ L* : 동위원소로 치환된(Labeled Compound,13C12) 내부표준물질
사. 정성시험위의 조건에서 얻어진 시험용액의 크로마토그램상의 각 피크를 표준용액의 표준물질 및 내부표준물질의 피크의 머무름 시간과 비교할 때 일치하여야 하며, 측정한 선택 이온 2개의 이온세기 비율(M/M+2 혹은 M+2/M+4)은 <표 2>에 나타난 이론비에 대하여 ±20% 이내이어야 한다.
아. 정량시험검량선 작성용 표준용액의 각각 표준물질의 피크면적(AS)과 내부표준물질 피크면적(A
IS)에 대한 비[A S/AIS]를 Y축으로 하고 표준물질의 농도를 X축으로 하여 검량곡선을 작성하고, 시험용액에서 얻어진 폴리염화비페닐의 피크면적과 내부표준물질의 면적비[A SAM/ASAMIS ]를 Y축에 대입하여 각각의 폴리염화비페닐 농도를 계산한 후 7종의 폴리염화비페닐 7종의 합을 폴리염화비페닐 7종(indicator PCBs 7종) 농도로 한다.
| 폴리염화비페닐 농도 (C, ng/g) |
= |
P |
× |
V |
| Ms |
| P |
:검량선에서 구한 폴리염화비페닐 농도(ng/mL) |
| V |
:최종부피(mL) |
| MS |
:시료 채취량(g) |
| 폴리염화비페닐 7종 농도 (ng/g) |
= |
∑Ci |
| Ci |
:i동족체의 폴리염화비페닐의 농도 (i =PCB 28, 52, 101, 118, 138, 153, 180) |
