9.7.2 액체크로마토그래피/질량분석기/질량분석기에 의한 시험
 
  
가. 시험법의 적용범위
 
  
불검출 기준 적용대상 식품
 
  
나. 분석원리
 
  
검체 중의 멜라민을 아세토니트릴․물(50:50, v/v) 용액으로 추출, 여과하고 이를 양이온교환수지를 사용하여 정제한 후 액체크로마토그래프/질량분석기/질량분석기로 분석한다.
 
  
다. 장치
 
  
1) 액체크로마토그래프/질량분석기/질량분석기(LC/MS/MS) 
 
 
  
2) 정제용 카트리지 : 설폰산기(-SO 
 3H)를 갖는 강산성 양이온교환수지 카트리지로서 Oasis MCX(150 mg 함유, 6 mL용) 또는 이와 동등한 것 
 
  
라. 시약 및 시액
 
  
1) 용매 : 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것 
 
 
  
2) 물 : 3차 증류수 또는 이와 동등한 것 
 
 
  
3) 표준원액 : 멜라민 표준품 10 mg을 취하여 0.1% 개미산․아세토니트릴(5:95, v/v) 혼합용액으로 녹여 정확히 100 mL로 한다. 
 
 
  
4) 표준용액 : 표준원액을 0.01, 0.02, 0.05, 0.10 및 0.20 μg/mL 농도가 되도록 0.1% 개미산․아세토니트릴(5:95, v/v) 혼합용액으로 희석하여 검량선 작성을 위한 표준용액으로 한다(사용시 조제한다). 
 
 
  
5) 0.1% 개미산용액 : 개미산(Formic acid) 0.1 mL에 물을 가하여 100 mL로 한다. 
 
 
  
6) 4% 개미산용액 : 개미산 4 mL에 물을 가하여 100 mL로 한다. 
 
 
  
7) 0.1% 개미산․아세토니트릴(5:95, v/v) 혼합용액 : 0.1% 개미산 용액 5mL에 아세토니트릴 95 mL를 가하여 100 mL로 한다. 
 
 
  
8) 0.2% 디에틸아민 함유 아세토니트릴 용액 : 디에틸아민(Diethylamine) 0.2 mL에 아세토니트릴을 가하여 100 mL로 한다. 
 
 
  
9) 2% 디에틸아민 함유 아세토니트릴 용액 : 디에틸아민 2 mL에 아세토니트릴을 가하여 100 mL로 한다. 
 
 
  
10) 20 mM 개미산암모늄(ammonium formate) 용액 : 개미산암모늄(Ammonium formate) 1.26 g을 물에 녹여 1,000 mL로 한다. 
 
 
  
11) 기타시약 : 특급 
 
 
  
마. 시험용액의 조제
 
  
1) 추출 
 
 
  
검체를 분쇄한 후 시료 1 g을 정밀히 달아 폴리프로필렌 원심분리관에 넣는다. 여기에 물 5 mL를 넣어 검체를 습윤시킨 후 아세토니트릴 5 mL를 가하여 심하게 흔들어 섞고 30분간 초음파 진탕한 다음 원심분리(2,600 ×G, 10분)한다. 상등액을 취하여 0.45 μm 멤브레인필터로 여과한 것을 추출액으로 한다(상등액의 층이 분리되어 있을 경우 서로 혼화시킨 후 여과한다).
 
  
2) 정제 
 
 
  
미리 아세토니트릴 5 mL, 4% 개미산용액 5 mL를 차례로 흘려 활성화시킨 정제용 카트리지에 4% 개미산용액 3 mL 및 추출액 2 mL를 함께 주입하고 이를 중력을 이용하여 유출시킨다. 이어서 아세토니트릴 5 mL, 0.2% 디에틸아민 함유 아세토니트릴용액 5 mL를 차례로 흘린 후 카트리지 내에 남아있는 용액을 감압펌프를 이용하여 제거하고 2% 디에틸아민 함유 아세토니트릴용액 4 mL로 용출시킨다. 카트리지 내에 남아있는 용액은 감압펌프를 이용하여 완전히 용출시켜 용출액에 합한다. 용출액 1 mL를 4 mL 바이알(Vial)에 취하여 50℃에서 질소로 건고한 후 잔류물에 0.1% 개미산․아세토니트릴(5:95, v/v) 혼합용액 1 mL를 가하여 녹인 것을 시험용액으로 한다.
 
  
바. 시험조작
 
  
1)액체크로마토그래프의 측정조건 
 
 
  
가) 칼럼 : HILIC Silica(2.1 × 150 mm, 5 μm) 또는 이와 동등한 것
 
  
나) 이동상은 A 및 B 용액의 농도 구배조건에 따라 사용한다.
 
  
이동상 A : 0.1% 개미산․아세토니트릴(5:95, v/v)
 
  
이동상 B : 20 mM 개미산암모늄(ammonium formate)․아세토니트릴(50:50, v/v)
 
  
 
   
 
    
 
     
 
시간(분)
 
 
     
 
이동상 A
 
 
     
 
이동상 B
 
 
    
 
    
 
     
 
0.0
 
 
     
 
100
 
 
     
 
0
 
 
    
 
    
 
     
 
5.0
 
 
     
 
100
 
 
     
 
0
 
 
    
 
    
 
     
 
10.0
 
 
     
 
25
 
 
     
 
75
 
 
    
 
    
 
     
 
11.0
 
 
     
 
25
 
 
     
 
75
 
 
    
 
    
 
     
 
13.0
 
 
     
 
100
 
 
     
 
0
 
 
    
 
    
 
     
 
15.0
 
 
     
 
100
 
 
     
 
0
 
 
    
 
   
 
  
 
  
다) 유속 : 0.25 mL/분
 
  
라) 주입량 : 10 μL
 
  
마) 칼럼온도 : 35℃
 
  
2) 질량분석기/질량분석기의 조건 
 
 
  
가)Ionization : ESI (Positive)
 
  
나) Source voltage : 4.8 kV
 
  
다) Capillary Temp. : 350℃
 
  
라) Auxiliary gas : 질소
 
  
마) Collision gas : 아르곤 또는 질소
 
  
바) Source collision energy : 15～30 V
 
  
3) 검량선 작성 
 
 
  
표준용액을 액체크로마토그래프/질량분석기/질량분석기에 주입한 후 얻어진 크로마토그램 상의 m/z 85 이온의 피크 높이 또는 면적을 이용하여 검량선을 작성한다.
 
  
4) 정량한계 : 0.15 mg/kg 
 
 
  
사. 정성시험
 
  
위의 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크는 표준용액 피크의 머무름 시간과 비교하여 일치 여부를 확인한다. 시험용액의 특성이온이 아래 표와 같이 확인되어야 하고 표준용액과 시험용액 이온간 반응세기의 비(m/z 85 이온에 대한 m/z 68 이온의 백분율, response ratio)를 비교하여 그 비가 ± 10% 이내에서 일치하여야 한다.
 
  
 
   
 
    
 
     
 
물 질
 
 
     
 
Precursor ion
 
(m/z)
 
 
     
 
Fragment ion
 
(m/z)
 
 
    
 
    
 
     
 
멜 라 민
 
 
     
 
127
 
 
     
 
85
 
68
 
 
    
 
   
 
  
 
  
아. 정량시험
 
  
정성시험과 동일한 조건에서 얻어진 시험용액의 크로마토그램으로부터 m/z 85 이온의 피크높이 또는 피크면적을 검량선에 대입하여 정량한다.
 
  
1) 계산 
 
 
  
멜라민의 함량(mg/kg) = C × V/S × D
 
  
C : 검량선에서 구한 멜라민의 농도 (μg/mL)
 
  
V : 시험용액의 최종 부피 (mL)
 
  
: 시료 채취량 (g)
 
  
D : 시험용액의 희석배수