- ▶ 제 8. 일반시험법 ▶ 9. 식품 중 유해물질 시험법 ▶ 9.8 패독소 ▶ 9.8.2 마비성 패독
9.8.2 마비성 패독
가. 시험법 적용범위패류, 피낭류, 패류 및 피낭류 통조림, 패류 및 피낭류 염장품, 패류 및 피낭류 건조가공품에 적용한다.
나. 분석원리균질화한 검체를 0.1 N 염산으로 가온 추출한 뒤 상층액을 마우스 복강 내에 주사하여 그 치사시간으로부터 MU(Mouse Unit)*을 구한 후 이를 마비성 패독으로환산한다.
*MU(Mouse Unit): 체중이 20 g인 마우스를15분에사망에 이르게 하는 독량을 1 MU로 정의한다.
다. 장치
1) 정제용 칼럼 : 크로마토그래피용 활성탄(100 mesh) 50 mL를 안지름 20 mm의 유리칼럼에 충전하여 사용하거나 또는 이와 동등한 것을 사용할 수 있다.
2) pH 측정기：표준완충액 pH 4.0, pH 7.0, pH 10.0으로 표준화 시킨 것
라. 시약 및 시액
1) 물 : 2차 증류수 및 이와 동등한 것
2) 표준용액 : 삭시톡신 표준물질에 3.0 mM 염산을 가하여 1 μg/mL 농도가 되도록 조제한다.
3) 1% 초산 함유 20% 에탄올용액 : 1 L 메스플라스크에 에탄올 200 mL를 넣고 물 500 mL를 섞은 후 초산 10 mL를 넣고 표시선까지 물로 채운다.
4) 5 N 염산 : 물 50 mL에 염산 47.5 mL을 가하고 물을 가해 100 mL로 한다
5) 0.1 N 염산 : 5 N 염산을 물로 50배 용량으로 희석하거나 물 50 mL에 염산 0.95 mL을 가하고 물을 가해 100 mL로 한다.
6) 0.01 N 염산 : 0.1 N 염산을 물로 10배 용량으로 희석하거나 물 100 mL에 염산 0.475 mL을 가하고 물을 가해 500 mL로 한다.
7) 3 mM 염산 : 물 50 mL에 0.1 N 염산 3 mL를 가하고 물을 가해 100 mL로 한다.
8) 0.1 N 수산화나트륨용액 : 수산화나트륨 0.40 g을 물을 가하여 녹인후 100 mL로 한다.
9) 기타 시약 : 특급
마. 시험용액의 조제
1) 검체의 손질
가) 패류, 피낭류패류 및 피낭류의 외부를 물로 깨끗이 씻고 10개체 이상 또는 껍질을 제거한 육이 200 g 이상이 되도록 손질 한다.(패류의 경우 패각을열고 내부의 모래나 이물질을 제거하기 위해 물로 씻은 후 칼로 패육을 취한다.) 이때 가열하거나 약품을 사용해서는 아니 된다. 육 전량을 표준체(20 mesh)에 얹어 5분 동안 물을 뺀 후 균질기로 균질화한다.
나) 패류 및 피낭류 통조림내용물 전량을 취해 균질화한다(대용량인 경우 표준체(20 mesh)에 얹어 2분간 고형물과 액체를 분리한 후 고형물과 액체의 중량을 측정하고 그 비율에 따라 200 g 이상을 취하여 균질화한다).
다) 패류 및 피낭류 염장품, 패류 및 피낭류 건조가공품검체 일정량을 분말로 만들거나 가늘게 잘라 균질화한다.
2) 추출
가) 패류, 피낭류, 패류 및 피낭류 통조림균질화한 검체 100 g을 비커에 달아 0.1 N 염산 100 mL를 가하고 교반하면서 5 N 염산이나 0.1 N 수산화나트륨용액으로 pH를 3.0으로 조정한다. 강염기성이 되면 독이 파괴되기 때문에 0.1 N 수산화나트륨용액으로 pH을 조정할 때에는 부분적인 파괴를 방지하기 위하여 격렬히 교반하면서 소량씩 적가한다. 혼합액을 5분간 끓이고 실온에서 식힌 후, pH가 3.0이 되도록 조정하고 물을 가하여 200 mL이 되게 한다. 비커에 옮긴 후 교반하고 상층부가 투명해질 때까지 정치하여 상층액을 시험용액으로 한다. 만약, 필요하면 원심분리(예: 1,200G에서 5분간)하여 얻은 상층액을 시험용액으로 사용하여도 된다.
나) 패류 및 피낭류 염장품, 패류 및 피낭류 건조가공품균질화한 검체 20 g을 비커에 달아 0.1 N 염산 100 mL를 가하여 패류의 추출방법에 따라 추출한다. 추출액 중 상층액 25 mL를 분취하여 pH 4.5～5.5로 조정한 다음 분당 3 mL 이하의 유속으로 정제용 유리칼럼을 통과시킨다. 물 100 mL로 칼럼을 세척한 후 1% 초산함유 20% 에탄올용액 150 mL로 용출시킨다. 용출액을 감압 농축하고 잔류물을 0.01 N 염산 10 mL에 녹여 시험용액으로 한다.
바. 시험조작(마우스 시험)
1) 마우스
ICR계의 또는 ddy계 동일계통의 생후 4주된 19～21 g의 건강한 수컷을 사용한다. 시험에 사용한 마우스는 표 2를 이용하여 마우스체중에 대해 보정한다.2) 시험
시험용액 1 mL을 2마리의 마우스 복강 내에 주사하고 주사 후부터 사망까지의 시간을 초단위로 기록한다. 사망 시에는 3마리 이상의 마우스를 취하여 복강 내에 주사하여 치사시간을 구한다. 다만, 마우스가 5분 이내에 사망한 경우 5～7분 정도에서 사망하도록 희석하여 치사시간을 구한다. 희석시에는 0.1 N 또는 0.01 N 염산으로 pH 2.0～4.0 되게 조정하여 사용한다.사. 계산
1) CF(Conversion Factor) 산출
표준용액 10 mL에 3.0 mM 염산을 10, 15, 20, 25 및 30 mL을 각각 가하여 희석 한 용액(이 액은 pH가 2.0～4.0이어야하며, 4.5를 넘어서는 안된다) 1 mL 씩을 각각 3마리 마우스에 복강 내 주사하고 주사 후부터 사망까지의 시간을 초단위로 기록하여 치사시간이 5～7분 사이가 되는 용액의 농도를 선택한다. 선택된 농도에 첨가되는 3.0 mM 염산의 양을 1 mL씩 증감하여 세 농도의 희석표준용액을 제조한다(표준용액 10 mL에 3.0 mM 염산 25 mL로 희석한 액이 선택된 경우, 표준용액 10 mL에 3.0 mM 염산 24 mL, 25 mL 및 26 mL을 각각 가하여 제조한다) 이 세 농도의 희석표준용액 1 mL 씩을 각각 10마리의 마우스 복강 내에 주사하여 치사시간을 구한다. 표 1에 의한 치사시간에 따른 MU와 표 2에 의한 마우스의 체중에 따른 MU를 곱한 보정된 MU들을 구하고, 이 보정된 MU들의 중앙값을 희석표준용액의 MU로 한다.CF는 각 희석표준용액의 CF를 평균하여 구한다.
| CF |
= |
희석표준용액의 농도(ug/mL) |
| MU |
2) CF를 이용한 마비성 패독 계산
시험용액 1 mL를 마우스에 주사하고 살아남은 것을 포함한 각 마우스의 치사시간으로부터 표 1에서 1 mL 당 MU를 구하고, 표 2에서 각 마우스체중에 대한 MU를 보정한 후 중앙값을 구한다(중앙값을 구할 때 60분 이상 살아있는 마우스의 치사시간에 대한 MU는 0.875이하로 간주).
CF에 마우스체중을 보정한 1 mL당 MU의 중앙값을 곱하여 1 mL당 μg의 마비성 패독으로 환산하고 다음 식에 의해 검체 중의 마비성 패독을 구한다.
마비성 패독(mg/kg) = CF × 치사시간 및체중보정에 의한 MU × 최종부피(mL)×희석배수 / 검체량(g)
표 1. 마비성 패독의 치사시간-MU 환산표(Sommer 표)
| 치사시간 (분:초) |
MU |
치사시간 (분:초) |
MU |
치사시간 (분:초) |
MU |
| 1:00 |
100.0 |
4:00 |
2.500 |
5:25 |
1.770 |
| 1:10 |
66.20 |
4:05 |
2.440 |
5:26 |
1.764 |
| 1:15 |
38.30 |
4:10 |
2.380 |
5:27 |
1.758 |
| 1:20 |
26.40 |
4:15 |
2.320 |
5:28 |
1.752 |
| 1:25 |
20.70 |
4:20 |
2.260 |
5:29 |
1.746 |
| 1:30 |
16.50 |
4:25 |
2.210 |
5:30 |
1.740 |
| 1:35 |
13.90 |
4:30 |
2.160 |
5:31 |
1.735 |
| 1:40 |
11.90 |
4:35 |
2.120 |
5:32 |
1.730 |
| 1:45 |
10.40 |
4:40 |
2.080 |
5:33 |
1.725 |
| 1:50 |
9.330 |
4:45 |
2.040 |
5:34 |
1.720 |
| 1:55 |
8.420 |
4:50 |
2.000 |
5:35 |
1.715 |
|
|
4:55 |
1.960 |
5:36 |
1.710 |
|
| 2:00 |
7.670 |
|
|
5:37 |
1.705 |
| 2:05 |
7.040 |
5:00 |
1.920 |
5:38 |
1.700 |
| 2:10 |
6.520 |
5:01 |
1.914 |
5:39 |
1.695 |
| 2:15 |
6.060 |
5:02 |
1.908 |
5:40 |
1.690 |
| 2:20 |
5.660 |
5:03 |
1.902 |
5:41 |
1.686 |
| 2:25 |
5.320 |
5:04 |
1.896 |
5:42 |
1.682 |
| 2:30 |
5.000 |
5:05 |
1.890 |
5:43 |
1.678 |
| 2:35 |
4.730 |
5:06 |
1.884 |
5:44 |
1.674 |
| 2:40 |
4.480 |
5:07 |
1.878 |
5:45 |
1.670 |
| 2:45 |
4.260 |
5:08 |
1.872 |
5:46 |
1.664 |
| 2:50 |
4.060 |
5:09 |
1.866 |
5:47 |
1.658 |
| 2:55 |
3.880 |
5:10 |
1.860 |
5:48 |
1.652 |
|
|
5:11 |
1.854 |
5:49 |
1.646 |
|
| 3:00 |
3.700 |
5:12 |
1.848 |
5:50 |
1.640 |
| 3:05 |
3.570 |
5:13 |
1.842 |
5:51 |
1.636 |
| 3:10 |
3.430 |
5:14 |
1.836 |
5:52 |
1.632 |
| 3:15 |
3.310 |
5:15 |
1.830 |
5:53 |
1.628 |
| 3:20 |
3.190 |
5:16 |
1.824 |
5:54 |
1.624 |
| 3:25 |
3.080 |
5:17 |
1.818 |
5:55 |
1.620 |
| 3:30 |
2.980 |
5:18 |
1.812 |
5:56 |
1.616 |
| 3:35 |
2.880 |
5:19 |
1.806 |
5:57 |
1.612 |
| 3:40 |
2.790 |
5:20 |
1.800 |
5:58 |
1.608 |
| 3:45 |
2.710 |
5:21 |
1.794 |
5:59 |
1.604 |
| 3:50 |
2.630 |
5:22 |
1.788 |
||
| 3:55 |
2.560 |
5:23 |
1.782 |
6:00 |
1.600 |
|
|
|
5:24 |
1.776 |
6:01 |
1.596 |
| 치사시간 (분:초) |
MU |
치사시간 (분:초) |
MU |
치사시간 (분:초) |
MU |
| 6:02 |
1.592 |
6:39 |
1.450 |
11:00 |
1.075 |
| 6:03 |
1.588 |
6:40 |
1.447 |
11:30 |
1.060 |
| 6:04 |
1.584 |
6:41 |
1.443 |
|
|
| 6:05 |
1.580 |
6:42 |
1.440 |
12:00 |
1.050 |
| 6:06 |
1.576 |
6:43 |
1.437 |
|
|
| 6:07 |
1.572 |
6:44 |
1.433 |
13:00 |
1.030 |
| 6:08 |
1.568 |
6:45 |
1.430 |
|
|
| 6:09 |
1.564 |
6:46 |
1.427 |
14:00 |
1.015 |
| 6:10 |
1.560 |
6:47 |
1.425 |
|
|
| 6:11 |
1.556 |
6:48 |
1.422 |
15:00 |
1.000 |
| 6:12 |
1.552 |
6:49 |
1.419 |
|
|
| 6:13 |
1.548 |
6:50 |
1.417 |
16:00 |
0.990 |
| 6:14 |
1.544 |
6:51 |
1.414 |
|
|
| 6:15 |
1.540 |
6:52 |
1.411 |
17:00 |
0.980 |
| 6:16 |
1.536 |
6:53 |
1.409 |
|
|
| 6:17 |
1.532 |
6:54 |
1.406 |
18:00 |
0.972 |
| 6:18 |
1.528 |
6:55 |
1.403 |
|
|
| 6:19 |
1.524 |
6:56 |
1.401 |
19:00 |
0.965 |
| 6:20 |
1.520 |
6:57 |
1.398 |
|
|
| 6:21 |
1.516 |
6:58 |
1.395 |
20:00 |
0.960 |
| 6:22 |
1.512 |
6:59 |
1.393 |
|
|
| 6:23 |
1.508 |
|
|
21:00 |
0.954 |
| 6:24 |
1.504 |
7:00 |
1.390 |
|
|
| 6:25 |
1.500 |
7:15 |
1.350 |
22:00 |
0.948 |
| 6:26 |
1.496 |
7:30 |
1.310 |
|
|
| 6:27 |
1.492 |
7:45 |
1.280 |
23:00 |
0.942 |
| 6:28 |
1.488 |
|
|
|
|
| 6:29 |
1.484 |
8:00 |
1.250 |
24:00 |
0.937 |
| 6:30 |
1.480 |
8:15 |
1.220 |
|
|
| 6:31 |
1.477 |
8:30 |
1.200 |
25:00 |
0.934 |
| 6:32 |
1.473 |
8:45 |
1.180 |
|
|
| 6:33 |
1.470 |
|
|
30:00 |
0.917 |
| 6:34 |
1.467 |
9:00 |
1.160 |
|
|
| 6:35 |
1.463 |
9:30 |
1.130 |
40:00 |
0.898 |
| 6:36 |
1.460 |
|
|
|
|
| 6:37 |
1.457 |
10:00 |
1.110 |
60:00 |
0.875 |
| 6:38 |
1.453 |
10:30 |
1.090 |
표 2. 마우스체중-MU 보정표
| 마우스 체중(g) |
MU |
마우스 체중(g) |
MU |
| 10.00 |
0.500 |
19.10 |
0.973 |
| 11.00 |
0.560 |
19.20 |
0.976 |
| 12.00 |
0.620 |
19.30 |
0.979 |
| 13.00 |
0.675 |
19.40 |
0.982 |
| 14.00 |
0.730 |
19.50 |
0.985 |
| 14.50 |
0.760 |
19.60 |
0.988 |
| 15.00 |
0.785 |
19.70 |
0.991 |
| 15.50 |
0.810 |
19.80 |
0.994 |
| 16.00 |
0.840 |
19.90 |
0.997 |
| 16.50 |
0.860 |
20.00 |
1.000 |
| 17.00 |
0.880 |
20.10 |
1.003 |
| 17.10 |
0.885 |
20.20 |
1.006 |
| 17.20 |
0.890 |
20.30 |
1.009 |
| 17.30 |
0.895 |
20.40 |
1.012 |
| 17.40 |
0.900 |
20.50 |
1.015 |
| 17.50 |
0.905 |
20.60 |
1.018 |
| 17.60 |
0.910 |
20.70 |
1.021 |
| 17.70 |
0.915 |
20.80 |
1.024 |
| 17.80 |
0.920 |
20.90 |
1.027 |
| 17.90 |
0.925 |
21.00 |
1.030 |
| 18.00 |
0.930 |
21.10 |
1.032 |
| 18.10 |
0.934 |
21.20 |
1.034 |
| 18.20 |
0.938 |
21.30 |
1.036 |
| 18.30 |
0.942 |
21.40 |
1.038 |
| 18.40 |
0.946 |
21.50 |
1.040 |
| 18.50 |
0.950 |
21.60 |
1.042 |
| 18.60 |
0.954 |
21.70 |
1.044 |
| 18.70 |
0.958 |
21.80 |
1.046 |
| 18.80 |
0.962 |
21.90 |
1.048 |
| 18.90 |
0.966 |
22.00 |
1.050 |
| 19.00 |
0.970 |
23.00 |
1.070 |
주1) 마비성 패독이 함유된 재료를 조작시에는 고무장갑을 사용할 것
