9.8.3 설사성 패독
가. 시험법 적용범위 : 이매패류
나. 분석원리이매패류의 패육을 취하여 균질화한 후 90% 메탄올로 추출하여 액체크로마토그래프/질량분석기/질량분석기로 분석한다.
다. 장치
1) 액체크로마토그래프/질량분석기/질량분석기
2) 막 여과지(membrane filter) : 0.45 μm 또는 이와 동등한 것
라. 시약 및 시액
1) 용매 : 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것
2) 물 : 3차 증류수 또는 이와 동등한 것
3) 표준원액 : Okadaic acid (OA)와 Dinophysistoxin-1 (DTX-1) 표준품을 정밀히 달아 메탄올로 용해하여 50 μg/mL이 되도록 한다. 표준원액은 영하 20℃ 이하에서 보관한다.
4) 표준용액 : 표준원액을 0.005, 0.010, 0.020, 0.050 및 0.100 μg/mL 농도가 되도록 90% 메탄올로 희석하여 검량선 작성을 위한 표준용액으로 한다(사용 시 조제한다).
5) 이동상 원액 : 90% 개미산 (Formic acid; HCOOH) 12.79 g (96% 개미산은 11.99 g, 98% 개미산은 11.74 g)과 개미산암모늄(Ammonium formate; NH
4COOH) 0.63 g을 250 mL 용량플라스크에 취하여 100 mL의 물로 용해하고 암모니아수를 이용하여 pH 2.3으로 조절한 후 물로 표시선까지 채운다.6) 추출용액 : 90% 메탄올(v/v)
마. 시험용액의 조제
1) 검체의 채취
검체는 폴리에틸렌 용기에 넣고 10℃ 이하로 유지하여 신속하게 운반한다. 단, 껍데기를 제거한 패육이 100 g 이상이 되도록 채취하여야 한다.2) 시료 조제
물로 패류의 외부를 깨끗이 씻은 후 껍데기를 제거하고, 내부의 모래나 이물질을 제거하기 위해 물로 씻은 후 칼로 패육을 취한다. 이때 가열하거나 약품을 사용해서는 아니 된다. 패육 100~150 g의 시료를 표준체(20 mesh)에 얹어 5분 동안 물을 뺀 후 균질기로 균질화한다.3) 추출
균질화한 시료 1 g을 비커에 달아 90% 메탄올 9 mL를 가하고 교반기를 이용하여 3분 동안 추출한다. 추출액을 15 mL 원심분리관에 넣고 90% 메탄올로 10 mL 눈금에 맞춘 후 원심분리(1,000 × G,5분)한다. 상등액 중 2 mL를 막 여과지(membrane filter)를 이용하여 여과한 것을 시험용액으로 한다.바. 시험조작
1) 액체크로마토그래프의 측정조건
가) 칼럼 : C18(2.0 × 150 mm,5 μm) 또는 이와 동등한 것
나) 이동상은 A 및 B 용액의 농도 구배조건에 따라 사용한다
이동상 A : 증류수․이동상원액(95:5, v/v)
이동상 B : 95% 아세토니트릴․이동상원액(95:5, v/v)
시간(분) |
A (%) |
B (%) |
0.0 |
80 |
20 |
10.0 |
0 |
100 |
15.0 |
0 |
100 |
17.0 |
80 |
20 |
20.0 |
80 |
20 |
다) 유속 : 0.2 mL/분
라) 주입량 : 5 μL
마) 칼럼온도 : 35℃
2)질량분석기/질량분석기의 조건
가) Ionization : ESI(Negative)
나)Source voltage : - 4.0 kV
다) Gas : 헬륨 또는 질소
라) Capillary Temperature : 300℃
3) 검량선 작성
표준용액을 액체크로마토그래프/질량분석기/질량분석기에 주입한 후 얻어진 크로마토그램 상의 특성이온의 피크 높이 또는 면적을 이용하여 검량선을 작성한다.
4) 정성시험
위의 조건으로 얻어진 시험용액 크로마토그램상의 특성이온 피크는 표준용액 특성이온 피크의 머무름 시간과 비교하여 일치 여부를 확인한다.
물질 |
Precursor ion (m/z) |
Fragment ion(m/z) |
OA |
804 |
255 |
DTX-1 |
818 |
255 |
5) 정량시험
정성시험과 동일한 조건에서 얻어진 시험용액 특성이온의 피크높이 또는 피크면적을 검량선에 대입하여 설사성 패독의 함량을 정량한다.
사. 계산
설사성 패독의 함량(μg/g) = (COA+ CDTX-1) × V/S
COA: 검량선에서 구한 Okadaic acid의 농도(μg/mL)
CDTX-1: 검량선에서 구한 Dinophysistoxin-1의 농도(μg/mL)
V : 시험용액의 최종부피(mL)
S : 시료의 채취량(g)