7.1.3.84 비사이클로피론(Bicyclopyrone)
 
  
 가. 시험법 적용범위곡류, 서류, 두류, 과일류, 채소류 등 식품에 적용한다.
 
  
 나. 분석원리시료 중 모화합물과 SYN503780기 및 CSCD686480기를 함유하는 대사산물들을 아세토니트릴로 모두 추출한 후 산화반응으로 모화합물은 SYN503780으로 변환하고, SYN503780기 및 CSCD686480기를 함유하는 대사산물들은 각각 SYN503780 및 CSCD686480으로 전환한다. 산화 반응액을 HLB 카트리지로 정제하여 액체크로마토그래프-질량분석기로 분석한다.
 
  
 다. 장치
 
  
 1) 액체크로마토그래프-질량분석기(LC-MS/MS)
 
  
 라. 시약 및 시액
 
  
 1) 용매 : 잔류농약 시험용 또는 특급
 
  
 2) 물 : 3차 증류수 또는 이와 동등한 것
 
  
 3) 표준원액 : SYN503780 및 CSCD686480 표준품을 각각 아세토니트릴에 녹여 1,000 mg/L가 되게 한다.
 
  
 4) 표준용액 : 표준원액을 무처리 시료 추출물을 이용하여 적당한 농도로 혼합, 희석한다(무처리 시료 추출물 90% 이상 포함).
 
  
 5) HLB 카트리지(Hydrophilic-Lipophilic Balance cartridge) : Divinylbenzene– N-vinyl pyrrolidone Copolymer(500 mg) 고정상이 충전되어 있는 일회용 카트리지(용량 6 mL) 또는 이와 동등한 것
 
  
 6) 기타시약 : 잔류농약 시험용 또는 특급
 
  
 마. 시험용액의 조제
 
  
 1) 추출
 시료 10 g을 정밀히 달아 추출 용기에 넣고( 곡류 및 두류 등 건조시료의 경우 물 20 mL를 넣고 30분간 방치 )아세토니트릴 50 mL 를넣어 10분간 강하게 흔들어 추출한다. 추출물을 여과지가 깔려있는 부흐너깔때기로 흡인 여과하고 아세토니트릴 20 mL로 잔류물 및 용기를 씻어내려 앞의 여과액과 합친 뒤 이를 40℃ 이하에서 감압 농축한다. 농축물에 30% 과산화수소수 1 mL와 0.05 M 수산화나트륨 1 mL를 넣고 초음파세척기 상에서 추출한 후 상온에서 3시간 동안 방치하여 산화반응시킨다. 산화반응물에 1 N 염산을 넣어 pH 2～3으로 맞춘다.
 
  
 2) 정제
 HLB 카트리지에 아세토니트릴 5 mL를 1～2 방울/초의 속도로 유출 시켜버린다. 고정상 상단이 노출되기 전에 ‘1) 추출’로부터 얻은 산화반응액에 물 3 mL를 넣고, 혼합하여 전량을 카트리지 상단에 넣고 1～2 방울/초의 속도로 유출시켜 버린다. 고정상 상단이 노출되기 직전에 아세토니트릴 : 물(5 : 95) 혼합액 5 mL를 유출시켜버리고, 재차 아세토니트릴 : 물(30 : 70) 혼합액 10 mL를 1～2 방울/초의 속도로 용출하여플라스크에 받는다. 용출액을 40℃ 이하에서 감압 농축하고 잔류물에 아세토니트릴 10 mL를 넣어 녹인 후 멤브레인 필터( Nylon, 0.2 μm)로 여과하여 시험용액으로 한다.
 
  
 바. 시험조작
 
  
 1) 액체크로마토그래프 분석조건
 
  
 가) 컬럼 : C18계 역상 컬럼 또는 이와 동등한 것
 
  
 나) 컬럼 온도 : 40℃
 
  
 다) 이동상
 
  
 (1) 이동상 A : 0.1% 포름산 함유 아세토니트릴
 
  
 (2) 이동상 B : 0.1% 포름산 함유 물
 
  
 (3) 농도구배조건
 
  
 
   
 
    
 
     
 
 시간(분)
 
 
     
 
 A(%)
 
 
     
 
 B(%)
 
 
    
 
    
 
     
 
 0.0
 
 
     
 
 10
 
 
     
 
 90
 
 
    
 
    
 
     
 
 3.0
 
 
     
 
 20
 
 
     
 
 80
 
 
    
 
    
 
     
 
 4.0
 
 
     
 
 50
 
 
     
 
 50
 
 
    
 
    
 
     
 
 5.5
 
 
     
 
 50
 
 
     
 
 50
 
 
    
 
    
 
     
 
 6.5
 
 
     
 
 45
 
 
     
 
 55
 
 
    
 
    
 
     
 
 7.0
 
 
     
 
 30
 
 
     
 
 70
 
 
    
 
    
 
     
 
 10.0
 
 
     
 
 10
 
 
     
 
 90
 
 
    
 
   
 
  
 
  
 라) 이동상 유속 : 0.3 mL/분
 
  
 마) 주입량 : 1 μL
 
  
 2) 질량분석기 분석조건
 
  
 가) 이온화 방법 : ESI positive-ion mode
 
  
 나) Capillary voltage : 1.7 kV
 
  
 다) Collision gas : 아르곤(Ar)
 
  
 라) Cone voltage : 14 V(SYN503780), 30 V(CSCD686480)
 
  
 마)액체크로마토그래프-질량분석기 분석을 위한 특성이온
 
  
 
   
 
    
 
     
 
 분석성분
 
 (Compound)
 
 
     
 
 분자량
 
 (MW)
 
 
     
 
 관측질량
 
 (Exact mass)
 
 
     
 
 선구이온
 
 (Precursor ion,m/z)
 
 
     
 
 생성이온(Product ion,m/z)
 
 
     
 
 충돌에너지
 
 (Collision energy, eV)
 
 
    
 
    
 
     
 
 SYN503780
 
 
     
 
 279.2
 
 
     
 
 279.0
 
 
     
 
 280
 
 
     
 
 2041)
 
 
     
 
 19
 
 
    
 
    
 
     
 
 59
 
 
     
 
 16
 
 
    
 
    
 
     
 
 CSCD686480
 
 
     
 
 265.2
 
 
     
 
 265.0
 
 
     
 
 266
 
 
     
 
 2041)
 
 
     
 
 16
 
 
    
 
    
 
     
 
 128
 
 
     
 
 34
 
 
    
 
   
 
  
 
  
 1)정량이온
 
  
 3) 검량선 작성
 표준용액을 농도별로 일정량 취하여 액체크로마토그래프-질량분석기에 각각 주입하여 얻은 크로마토그램상의 각 피크 높이 또는 면적 값으로 검량선을 작성한다.
 
  
 4) 표준품의 크로마토그램
 
  
 
 
  
 그림 1. 액체크로마토그래프-질량분석기에서 표준품의 크로마토그램.
 
  
 A : SYN503780(5.4분), B : CSCD686480(4.9분)
 
  
 * 분석기기 : LC(AcqutiyⓇUPLC), MS/MS(XevoⓇTQ-S)
 
  
 컬럼(XBridgeⓇC18,2.1 mm I.D.× 100 mm L., 3.5 μm)
 
  
 5) 정량한계
 SYN503780 : 0.005 mg/kg, CSCD686480 : 0.005 mg/kg
 
  
 사. 정량시험위 조건으로 얻어진 각 크로마토그램상의 피크가 표준용액 피크의 머무름 시간과 일치할 때 피크 높이 또는 면적을 검량선에 대입하여 정량한 후 각각의 환산계수를 곱하여 비사이클로피론으로 정량한다.
 
  
 * 비사이클로피론 환산계수① SYN503780에 대한 비사이클로피론 환산계수 = 1.43(비사이클로피론 분자량 399/SYN503780 분자량 279)② CSCD686480에 대한 비사이클로피론 환산계수 = 1.51(비사이클로피론 분자량 399/CSCD686480 분자량 265)
 
  
 아. 확인시험액체크로마토그래프-질량분석기상의 머무름 시간과 특성이온으로 SYN503780 및 CSCD686480을 확인한다.