- ▶ 제 8. 일반시험법 ▶ 6. 식품별 규격 확인 시험법 ▶ 6.3 식용유지류 ▶ 6.3.2 동물성유지류 ▶ 6.3.2.3 어유
6.3.2.3.1 인지질
가. 핵자기공명분광기에 의한 정량(제1법)
1) 시험법 적용범위
크릴유에 적용한다.
2) 분석원리
시료 중의 인지질을 클로로포름과 메탄올로 추출 후 핵자기공명분광기를 이용하여 정량하는 방법이다.
3) 장치 및 기구
가) 장치
(1) 핵자기공명분광기(NMR, 최소 300 Mhz 이상)
나) 기구
(1) 유리 메디아병(250 mL)
(2) 유리바이알
(3) 1 mL 케미칼 실험용 일회용 주사기(all plastic syringe)
(4) 칼·가위 등의 커팅 도구
(5) 유리섬유 시린지 필터
(6) 교반기(vortex mixer)
(7) 원심분리기
(8) 질소농축기
(9) 분석저울(0.0001g 까지 측정 가능)
4) 시약 및 시액
가) 시약
(1) 증류수
(2) 중수소클로로포름(chloroform-d)[중수소비율: 99.8 이상, 테트라메틸실란(tetramethylsilane) 0.05% (v/v)]
(3) 중수소메탄올(methanol-d4)[중수소비율: 99.8 이상, 테트라메틸실란(tetramethylsilane) 0.05% (v/v)]
(4) 탄산세슘(Cesium carbonate, CsCO3)
(5) 이.디.티.에이(EDTA(Ethylene diamine tetraacetic acid))
(6) 클로로포름(HPLC grade)
(7) 메탄올(HPLC grade)
나) 내부표준물질
(1) 트리페닐인산(Triphenyl phosphate)(TPP, 31P-qNMR Standard grade)
다) 시액
(1) 클로로포름/메탄올 혼합액: 클로로포름, 메탄올을 2:1의 부피비로 혼합하여 조제한다.
(2) 이.디.티.에이, 탄산세슘 혼합액: 0.2 M 이.디.티.에이 용액을 제조한 후, 1 M 탄산세슘 용액을 이용하여 pH를 7.2 ～ 7.5로 하여 조제한다.
5) 시험용액의 조제
가) 액상 시료
(1) 유리바이알에 트리페닐인산 20 ～ 25 mg를 넣은 뒤 정확한 무게를 기록하고, 300 ～ 350 mg의 액상(원료) 시료를 넣고 정확한 무게를 기록한다.
(2) 유리바이알에 중수소클로로포름, 중수소메탄올을 각각 1 mL씩 넣고 잘 녹인 후 이.디.티.에이, 탄산세슘 혼합액을 1 mL 씩 넣고 30분간 충분히 섞은 후 원심분리한다. 하부의 유기용매층을 핵자기공명분광기 튜브에 옮겨 담은 것을 시험용액(최소 0.6 mL 이상)으로 한다.
나) 캡슐 제품
(1) 캡슐 제품의 경우, 크릴유 5g 정도에 해당하는 수의 캡슐을 핀셋, 커팅도구를 이용해 반으로 자른 뒤 유리 메디아병에 넣고, 핀셋, 면도칼(커팅도구)에 묻은 시료는 클로로포름/메탄올 혼합용액으로 씻어내어 유리 메디아병에 합친다. 50 mL의 클로로포름/메탄올 혼합용액을 추가하여 넣고 내용물을 완전히 용해시킨 후, 100 mL 부피플라스크에 옮긴다. 유리병, 빈 캡슐 등은 30 mL의 클로로포름/메탄올 혼합용액으로 씻어내어 부피플라스크에 합치고 클로로포름/메탄올 혼합용액으로 부피플라스크의 표선까지 채워 균일하게 섞은 것을 시험원액으로 한다.
(2) 유리바이알에 트리페닐인산 20 ～ 25 mg을 넣은 뒤 정확한 무게를 기록한다. 여기에 크릴유 300 ～ 350 mg에 해당하는 시험원액(통상, 캡슐 당 내용량이 1,000 mg일 경우, 6 mL을 취한다.)을 넣은 후 가해진 시험원액의 정확한 양을 기록하고 질소농축기를 이용하여 용매를 완전히 제거한다.
(3) 유리바이알에 중수소클로로포름과 중수소메탄올을 각각 2 mL씩 넣고 잘 녹인 후 이.디.티.에이, 탄산세슘 혼합액을 2 mL 넣고 30분간 충분히 섞은 후 원심분리한다. 하층의 유기용매층을 핵자기공명분광기 튜브에 옮겨 담은 것을 시험용액(최소 0.6 mL 이상)으로 한다.
6) 분석 및 계산
가) 핵자기공명분광기의 측정조건
※ 감도(sensitivity) 및 선모양(line shape) 테스트는 핵자기공명분광기 제조사에서 규정하는 점검 기간 내에 수행되어져야 한다. 이때, 최소 월간점검의 수행이 요구되며 분해능(Resolution) 테스트는 매 분석 시 마다 수행하고 분석결과와 함께 제시하여야 한다.
(1) 반복측정(number of transients) : 128회 이상
(2) 측정 간 이완 시간(relaxation delay) : 10 sec 이상
(3) FID(free induction decay) 측정 시간(acquisition time) : 5 sec 이상
(4) 펄스 넓이(pulse width) : 45○
(5) 측정 온도(temperature) : 25°C
(6) 펄스 프로그램(pulse program) : 1H-decoupled 31P (inverse gated)
(7) 스펙트럼 폭(spectral width) : 50 ppm(-25 ppm to 25 ppm)
(8) 트랜스미터 오프셋(transmitter offset) : 스펙트럼 폭의 중심, 0 ppm
(9) 데이터 셋의 크기(size of data set) : 64K (32K with zero-filling) 이상
나) 계산
(1) 계산
(가) 인지질 함량(wt/wt%) = 포스파티딜콜린(PC) 함량(wt/wt%) + 리소포스파티딜콜린(1-리소포스파티딜콜린(1-LPC)과 2-리소포스파티딜콜린(2-LPC)) 함량(wt/wt%) + 포스파티딜에탄올아민(PE) 함량(wt/wt%) + N-아실-포스파티딜에탄올아민(NAPE) 함량(wt/wt%) + 리소포스파티딜에탄올아민(LPE) 함량(wt/wt%) + 기타(Others) 함량(wt/wt%)
(나) 각 인지질 함량(wt/wt%)
CPL(wt%) = (MWPL x molPL x 100) / WS
CPL = 시험용액 중 개별 인지질의 함량(%, w/w)
MWPL = 개별 인지질의 분자량(g/mol, 표 1. 참고)
Ws = 시료채취량(g)
※ 캡슐 제품의 경우, 동 시험과는 별도로 캡슐 당 내용량 확인시험을 하여야 하며, Ws = 시험원액을 취한 부피(mL) × 시험원액 농도[(1캡슐 당 내용량(mg/캡슐) × 캡슐 수) ÷ 100mL]
molPL = 시험용액 중 개별 인지질의 mole수(mol) = (IPL x AIS x molIS) / (IIS x APL)
| IIS= 내부표준물질의 피크면적 IPL= 개별 인지질의 피크면적 AIS= 내부표준물질의 분자당 인의 원자수(atoms/mol) APL= 개별 인지질의 분자당 인의 원자수(atoms/mol) molIS= 시험용액 중 내부표준물질의 mole수(mol) =(WISx CIS) / (MW
|
[IMG NAME : PIC1922148070]
그림 1. 크릴유의 인 핵자기공명(31P NMR) 스펙트럼
| 성분 |
Chemical shift (ppm) |
분자량 (g/mol) |
분자당 인의 수 |
| TPP(Triphenyl phosphate, internal STD) |
-17.8 |
326.3 |
1 |
| PC(Phosphatidylcholine) |
-0.93 |
791 |
1 |
| 1-LPC(1-Lysophosphatidylcholine) |
-0.49 |
534.5 |
1 |
| 2-LPC(2-Lysophosphatidylcholine) |
-0.39 |
534.5 |
1 |
| PE(Phosphatidylethanolamine) |
-0.19 |
770 |
1 |
| NAPE(N-acyl-phosphatidylethanolamine) |
-0.06 |
1032 |
1 |
| LPE(Lysophosphatidylethanolamine) |
0.29 |
492.5 |
1 |
| 기타 |
|
800 |
|
나. 액체크로마토그래프에 의한 정량(제2법)
1) 시험법 적용범위
크릴유의 제조·가공기준 확인시 제1법을 대체하여 사용할 수 있다. 이때 제2법에 따른 판정이 제1법에 따른 판정과 상이한 경우에는 제1법의 결과를 우선한다.
2) 분석원리
시료 중의 인지질을 클로로포름과 메탄올로 추출 후 질소로 농축한 후 헥산과 이소프로판올로 녹여 순상칼럼으로 분리한 후 액체크로마토그래프/증기화광산란검출기를 이용하여 정량하는 방법이다.
3) 장치 및 기구
가) 장치
액체크로마토그래프/증기화광산란검출기(LC/ELSD)
나) 기구
(1) 유리 메디아병(250 mL)
(2) 유리바이알
(3) 부피플라스크(10 mL, 100 mL 및 200 mL)
(4) 멤브레인 필터(0.45 μm)
(5) 1 mL 케미칼실험용 일회용 주사기(all plastic syringe)
(6) 칼·가위 등의 커팅 도구
(7) 유리섬유 시린지 필터
(8) 교반기(vortex mixer)
(9) 원심분리기
(10) 질소농축기
(11) 분석저울(0.0001g 까지 측정 가능)
4) 시약 및 시액
가) 시약
(1) 증류수 : 3차 증류수
(2) n-헥산 : HPLC grade
(3) 이소프로판올 : HPLC grade
(4) 아세트산
(5) 트리에틸아민
(6) 클로로포름 : HPLC grade
(7) 메탄올 : HPLC grade
(8) 포스파티딜콜린(Phosphatidylcholine) : CAS No. 97281-47-5 또는 이와 동등한 것
(9) 리소포스파티딜콜린(1-palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine, LPC) : CAS No. 17364-16-8 또는 이와 동등한 것
(10) 포스파티딜에탄올아민(Phosphatidylethanolamine, PE) : CAS No. 39382-08-6 또는 이와 동등한 것
(11) N-아실-포스파티딜에탄올아민(N-acyl-Phosphatidylethanolamine, NAPE) : European Pharmacopoeia (EP) Reference Standard 또는 이와 동등한 것
나) 표준용액
(1) 표준원액 : 포스파티딜콜린, 리소포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, N-아실-포스파티딜에탄올아민을 각각 100 mg을 n-헥산/이소프로판올 혼합액(8:2, v/v) 100 mL에 녹여 조제한다.
(2) 표준용액 : 표준원액을 n-헥산/이소프로판올 혼합액(8:2, v/v)로 적절히 희석하여 표준용액으로 한다.
다) 시액
(1) n-헥산/이소프로판올 혼합액 : n-헥산과 이소프로판올을 8:2의 부피비로 혼합하여 조제한다.
(2) 클로로포름/메탄올 혼합액 : 클로로포름, 메탄올을 2:1의 부피비로 혼합하여 조제한다.
(3) 이동상 A : n-헥산, 이소프로판올, 아세트산 및 트리에틸아민을 81.42:17.00:1.50:0.08의 부피비로 혼합한 후 0.45 μm 여지로 여과하고 탈기하여 조제한다.
(4) 이동상 B : 이소프로판올, 증류수, 아세트산, 트리에틸아민을 84.42:14.00:1.50:0.08의 부피비로 혼합한 후 0.45 um 여지로 여과하고 탈기하여 조제한다.
5) 시험용액 조제
가) 시험원액 조제
(1) 액상 시료
액상의 시료 약 2,500 mg을 취하여 100 mL 부피플라스크에 넣은 후 n-헥산/이소프로판올 혼합액을 넣어 녹인 뒤, n-헥산/이소프로판 혼합액으로 정용한 것을 시험원액으로 한다.
(2) 캡슐 제품
캡슐 제품인 경우, 크릴유 5g 정도에 해당하는 수의 캡슐을 핀셋, 커팅도구를 이용해 반으로 자른 뒤 유리 메디아병에 넣고, 핀셋, 면도칼(커팅도구)에 묻은 시료는 클로로포름/메탄올 혼합용액으로 씻어내어 유리 메디아병에 합친다. 50 mL의 클로로포름/메탄올 혼합용액을 추가하여 넣고 내용물을 완전히 용해시킨 후, 100 mL 부피플라스크에 옮긴다. 유리병, 빈 캡슐 등을 30 mL의 클로로포름/메탄올 혼합용액으로 씻어내어 부피플라스크에 합치고 클로로포름/메탄올 혼합용액으로 부피플라스크의 표선까지 채워 균일하게 섞은 것을 시료액(★)으로 한다. 유리바이알에 크릴유 시료액(약 5mL)을 넣은 후 질소 농축기를 이용하여 용매를 완전히 제거한다. 용매가 제거된 유리바이알에 n-헥산/이소프로판올 혼합용액을 소량 넣고 녹인 후, 10 mL 부피플라스크로 옮긴 뒤 n-헥산/이소프로판올 혼합용액으로 정용한 것을 시험원액(☆)으로 한다.
나) 시험용액 조제
시험원액을 0.45 μm 나일론 멤브레인 필터로 여과한 여과액을 포스파티딜에탄올아민, N-아실-포스파티딜에탄올아민의 시험용액으로 하고, 여과액을 n-헥산/이소프로판올 혼합용액으로 2배 희석하여 리소포스파티딜콜린의 시험용액으로 하고, 여과액을 n-헥산/이소프로판올 혼합용액으로 20배 희석하여 포스파티딜콜린의 시험용액으로 한다.
6) 시험방법
가) 액체크로마토그래프 조건
(1) 칼럼 : Diol-bounded silica column(4.0 mm × 250 mm, 5 μm) 또는 이와 동등한 것
(2) 칼럼온도 : 55℃
(3) Drift tube Temp. : 50℃
(4) 증기화광산란검출기 Pressure(N2 gas) : 2.5 bar
(5) 유 속 : 1.0 mL/min
(6) 주입량 : 20 μL
(7) 이동상
(가) 이동상 A : n-헥산:이소프로판올:아세트산:트리에틸아민(81.42:17.00:1.50:0.08, v/v/v/v)
(나) 이동상 B : 이소프로판올:증류수:아세트산:트리에틸아민(84.42:14.00:1.50:0.08, v/v/v/v)
| 시간(분) |
이동상 A(%) |
이동상 B(%) |
| 0 |
95 |
5 |
| 5 |
80 |
20 |
| 8.5 |
60 |
40 |
| 15.0 |
0 |
100 |
| 17.5 |
95 |
5 |
| 34.0 |
95 |
5 |
나) 검량선 작성
각 표준용액을 농도별로 일정량 취하여 액체크로마토그래프/증기화광산란검출기에 각각 주입한다. 얻어진 크로마토그램 상의 각 피크 면적을 구하고 검량선을 작성한다.
7) 정량시험
표준용액과 시험용액의 크로마토그램상의 피크의 머무름 시간과 일치할 때 면적을 검량선에 대입하여 시험용액 중의 각 인지질(포스파티딜콜린, 리소포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, N-아실-포스파티딜에탄올아민)의 농도(mg/mL)를 구한다.
가) 인지질 함량(wt/wt%) = [포스파티딜콜린 함량(wt/wt%) + 리소포스파티딜콜린 함량(wt/wt%) + 포스파티딜에탄올아민 함량(wt/wt%) + N-아실-포스파티딜에탄올아민 함량(wt/wt%)] × 1.07
나) 각 인지질 함량(wt/wt%) = C × V/S × 희석배수 × [IMG NAME : EQUATION1922148074]
C : 검량선으로부터 얻은 시료의 각 인지질 농도(mg/mL)
V : 시험원액(☆)의 최종부피 (= 10 mL)
희석배수 : N-아실-포스파티딜에탄올아민(1), 리소포스파티딜콜린(2), 포스파티딜콜린(20)
S : 시료 채취량 (g)
※ 캡슐 제품의 경우, 동 시험과는 별도로 캡슐 당 내용량 확인 시험을 하여야 하며, S = 시료액(★) 취한 부피(5 mL) × 시료액 농도[(1캡슐 당 내용량(g/캡슐) × 캡슐 수) ÷ 100 mL]
[IMG NAME : EQUATION1922148075]: 단위환산
