- ▶ 제 8. 일반시험법 ▶ 7. 식품 중 잔류농약 시험법 ▶ 7.1 식품일반 ▶ 7.1.3 단성분 시험법(Individual residue methods) ▶ 7.1.3.89 스트렙토마이신(Streptomycin)
7.1.3.89 스트렙토마이신(Streptomycin)
가. 시험법 적용범위곡류, 서류, 두류, 과일류, 채소류 등 식품에 적용한다.
나. 분석원리시료를 메탄올로 추출하고 HLB 카트리지로 정제하여 액체크로마토그래프-질량분석기로분석한다.
다. 장치
1) 액체크로마토그래프-질량분석기(LC-MS/MS)
라. 시약 및 시액
1) 용매 : 잔류농약 시험용 또는 특급
2) 물 : 3차 증류수 또는 이와 동등한 것
3) 표준원액 : 표준품(Streptomycin sulfate)을 물에 녹여 1,000 mg/L가 되게 한다.
4) 표준용액 : 표준원액을 무처리 시료 추출물을 이용하여 적당한 농도로 혼합, 희석한다(무처리 시료 추출물 90% 이상 포함).
5) HLB 카트리지(Hydrophilic-Lipophilic Balance cartridge) : divinylbenzene- N- vinylpyrrolidone copolymer(500 mg) 고정상이 충전되어 있는 일회용 카트리지(용량 6 mL) 또는 이와 동등한 것
6) 기타시약 : 잔류농약 시험용 또는 특급
7) 특이사항 : 스트렙토마이신은 유리 벽면에 흡착할 가능성이 있으므로 모든 시험과정에서 폴리프로필렌 재질의 용기를 사용한다.
마. 시험용액의 조제
1) 추출
시료 5 g을 정밀히 달아 50 mL 원심분리관에 넣고(곡류의 경우 물 5 mL, 두류의 경우 물 10 mL를 넣고 30분간 방치) 메탄올 20 mL를 넣어 강하게 흔들고 포름산을 넣어 추출용액의 pH를 3으로 맞춘다. 추출물에 염화나트륨 2 g을 넣어 강하게 흔들고 15분간 강하게 흔들어 섞은 후, 4℃, 7,500 G에서 10분간 또는 이와 동등한 조건에서 원심분리하여 상층액 전량을 취한다(두류의 경우 원심분리관을 4℃, 7,500 G에서 5분간 또는 이와 동등한 조건에서 한 번 더 원심분리하여 상층액 전량을 취하고 앞의 상층액과 합함). 새 원심분리관에 취하여진 상층액은 메탄올을 이용하여 부피를 25 mL로 맞춘다.2) 정제
HLB 카트리지에 메탄올 3 mL와 물 3 mL를 차례로 넣어 2～3 방울/초의 속도로 유출시켜 버린다. 고정상 상단이 노출되기 전에 ‘1) 추출’로부터 얻은 용액 5 mL를 카트리지 상단에 넣고 1～2 방울/초의 속도로 용출하여받고, 고정상 상단이 노출되기 전에 메탄올 5 mL를 카트리지 상단에 넣고 1～2 방울/초의 속도로 용출하여 앞서 받은 액과 합쳐 부피를 10 mL로 맞춘다. 정제된 용액을 멤브레인 필터(Nylon, 0.2 μm)로 여과한 후 시험용액으로 한다.바. 시험조작
1) 액체크로마토그래프 분석조건
가) 컬럼 : amide계 컬럼 또는 이와 동등한 것
나) 컬럼 온도 : 40℃
다) 이동상
(1) 이동상 A : 아세토니트릴
(2) 이동상 B : 150 mM 포름산암모늄 함유 물(포름산을 이용하여 pH를 4.5로 조절)
(3) 농도구배조건
| 시간(분) |
A(%) |
B(%) |
| 0.0 |
95 |
5 |
| 2.0 |
95 |
5 |
| 6.0 |
0 |
100 |
| 7.0 |
0 |
100 |
| 7.1 |
95 |
5 |
| 10.0 |
95 |
5 |
라) 이동상 유속 : 0.3 mL/분
마) 주입량 : 5 μL
2) 질량분석기 분석조건
가) 이온화 방법 : ESI positive-ion mode
나) Capillary voltage : 3.3 kV
다)Collision gas : 아르곤(Ar)
라)액체크로마토그래프-질량분석기 분석을 위한 특성이온
| 분석성분 (Compound) |
분자량 (MW) |
관측질량 (Exact mass) |
선구이온 (Precursor ion,m/z) |
생성이온(Product ion,m/z) |
충돌에너지 (Collision energy, eV) |
| 스트렙토마이신 (Streptomycin) |
581.6 |
581.2 |
582 |
2631) |
30 |
| 221 |
36 |
||||
| 246 |
38 |
1)정량이온
3) 검량선 작성
표준용액을 농도별로 일정량 취하여 액체크로마토그래프-질량분석기에 각각 주입하여 얻은 크로마토그램상의 각 피크 높이 또는 면적 값으로 검량선을 작성한다.
4) 표준품의 크로마토그램
그림 1. 액체크로마토그래프-질량분석기에서 표준품의 크로마토그램 예시.스트렙토마이신(5.2분)
* 분석기기 : LC(WatersⓇAcquity UPLC), MS/MS(WatersⓇXevo TQ-S),컬럼(XBridgeⓇamide, 2.1 mm I.D. × 100 mm L., 3.5 μm)
5) 정량한계
0.01 mg/kg
사. 정량시험위 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크가 표준용액 피크의 머무름 시간과 일치할 때 피크 높이 또는 면적을 검량선에 대입하여 정량한다.
아. 확인시험액체크로마토그래프-질량분석기상의 머무름 시간과 특성이온으로 스트렙토마이신을 확인한다.
