7.1.3.90 발리다마이신-에이(Validamycin-A)
 
  
 가. 시험법 적용범위곡류, 서류, 두류, 과일류, 채소류 등 식품에 적용한다.
 
  
 나. 분석원리시료를 메탄올 : 물(50 : 50) 혼합액으로 추출한 후 HLB 카트리지로 정제하여 액체크로마토그래프-질량분석기로 분석한다.
 
  
 다. 장치
 
  
 1) 액체크로마토그래프-질량분석기(LC-MS/MS)
 
  
 라. 시약 및 시액
 
  
 1) 용매 : 잔류농약 시험용 또는 특급
 
  
 2) 물 : 3차 증류수 또는 이와 동등한 것
 
  
 3) 표준원액 : 표준품을 메탄올에 녹여 1,000 mg/L가 되게 한다.
 
  
 4) 표준용액 : 표준원액을 무처리 시료 추출물을 이용하여 적당한 농도로 혼합, 희석한다(무처리 시료 추출물 90% 이상 포함).
 
  
 5) HLB 카트리지(Hydrophilic-Lipophilic Balance cartridge) : divinylbenzene- N- vinylpyrrolidone copolymer(500 mg) 고정상이 충전되어 있는 일회용 카트리지(용량 6 mL) 또는 이와 동등한 것
 
  
 6) 기타시약: 잔류농약 시험용 또는 특급
 
  
 7) 특이사항: 발리다마이신에이는 유리 벽면에 흡착할 가능성이 있으므로 모든 시험과정에서 폴리프로필렌 재질의 용기를 사용한다.
 
  
 마. 시험용액의 조제
 
  
 1) 추출
 시료 5 g을 정밀히 달아 폴리프로필렌 용기에 넣고 메탄올 : 물(50 : 50) 혼합액을 10 mL를 넣어 10분간 강하게 흔들어 추출한 후 4℃, 4,500 G, 10분간 또는 이와 동등한 조건에서 원심 분리한다. 상층액을 모두 옮긴 후 메탄올 : 물(50 : 50) 혼합액을 10 mL를 넣어 위 과정을 반복한다(2회). 앞의 여과액과 합친 후 물을 이용하여 부피를 25 mL로 맞춘다.
 
  
 2) 정제
 HLB 카트리지에 3 mL의 메탄올과 물을 차례로 넣어 2～3 방울/초의 속도로 유출시켜버린다. 이어서 고정상 상단이 노출되기 전에 ‘1) 추출’로부터 얻은 추출액 5 mL를 카트리지에 넣고 1～2 방울/초의 속도로 용출하여받고 고정상 상단이 노출되기 전에 물 5 mL를 용출하여받는다. 이 과정을 통해 얻은 용액 10 mL를 멤브레인 필터(PVDF, 0.2 μm)로 여과한 후 시험용액으로 한다.
 
  
 바. 시험조작
 
  
 1) 액체크로마토그래프 분석조건
 
  
 가) 컬럼 : amide계 컬럼 또는 이와 동등한 것
 
  
 나) 컬럼 온도 : 40℃
 
  
 다) 이동상
 
  
 (1) 이동상 A : 아세토니트릴
 
  
 (2) 이동상 B : 5 mM 암모늄 아세테이트 함유 물
 
  
 (3) 농도구배조건
 
  
 
   
 
    
 
     
 
 시간(분)
 
 
     
 
 A(%)
 
 
     
 
 B(%)
 
 
    
 
    
 
     
 
 0.0
 
 
     
 
 100
 
 
     
 
 0
 
 
    
 
    
 
     
 
 2.5
 
 
     
 
 100
 
 
     
 
 0
 
 
    
 
    
 
     
 
 2.6
 
 
     
 
 10
 
 
     
 
 90
 
 
    
 
    
 
     
 
 7.0
 
 
     
 
 10
 
 
     
 
 90
 
 
    
 
    
 
     
 
 8.0
 
 
     
 
 100
 
 
     
 
 0
 
 
    
 
    
 
     
 
 10.0
 
 
     
 
 100
 
 
     
 
 0
 
 
    
 
   
 
  
 
  
 라) 이동상 유속 : 0.2 mL/분
 
  
 마) 주입량 : 5 μL
 
  
 2) 질량분석기 분석조건
 
  
 가) 이온화 방법 : ESI positive-ion mode
 
  
 나) Capillary voltage : 3.0 kV
 
  
 다) Collision gas :아르곤(Ar)
 
  
 라)액체크로마토그래프-질량분석기 분석을 위한 특성이온
 
  
 
   
 
    
 
     
 
 분석성분
 
 (Compound)
 
 
     
 
 분자량
 
 (MW)
 
 
     
 
 관측질량
 
 (Exact mass)
 
 
     
 
 선구이온
 
 (Precursor ion,m/z)
 
 
     
 
 생성이온(Product ion,m/z)
 
 
     
 
 충돌에너지
 
 (Collision energy, eV)
 
 
    
 
    
 
     
 
 발리다마이신에이
 
 (Validamycin A)
 
 
     
 
 497.5
 
 
     
 
 497.2
 
 
     
 
 498
 
 
     
 
 1781)
 
 
     
 
 23
 
 
    
 
    
 
     
 
 336
 
 
     
 
 26
 
 
    
 
   
 
  
 
  
 1)정량이온
 
  
 3) 검량선 작성
 표준용액을 농도별로 일정량 취하여 액체크로마토그래프-질량분석기에 각각 주입하여 얻은 크로마토그램상의 각 피크 높이 또는 면적 값으로 검량선을 작성한다.
 
  
 4) 표준품의 크로마토그램
 
  
 
 그림 1. 액체크로마토그래프-질량분석기에서 표준품의 크로마토그램 예시.발리다마이신에이(4.5분)
 * 분석기기 : LC(AcqutiyⓇUPLC), MS/MS(XevoⓇTQ-S),컬럼(XBridgeⓇamide, 2.1 mm I.D. × 100 mm L., 3.5 μm)
 
  
 5) 정량한계
 0.01 mg/kg
 
  
 사. 정량시험위 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크가 표준용액 피크의 머무름 시간과 일치할 때 피크 높이 또는 면적을 검량선에 대입하여 정량한다.
 
  
 아. 확인시험액체크로마토그래프-질량분석기상의 머무름 시간과 특성이온으로 발리다마이신에이를 확인한다.