7.1.3.96 피녹사덴(Pinoxaden)
 
  
 가. 시험법 적용범위곡류, 서류, 두류, 과일류, 채소류 등 식품에 적용한다.
 
  
 나. 분석원리시료를 1 N 염산으로 추출한 후 HLB 카트리지로 정제하여 액체크로마토그래프-질량분석기로 분석한다.
 
  
 다. 장치
 
  
 1) 액체크로마토그래프-질량분석기(LC-MS/MS)
 
  
 라. 시약 및 시액
 
  
 1) 용매 : 잔류농약 시험용 또는 특급
 
  
 2) 물 : 3차 증류수 또는 이와 동등한 것
 
  
 3) 표준원액 : 피녹사덴 대사산물(M4)을 아세토니트릴에 녹여 1,000 mg/L가 되게 한다.
 
  
 4) 표준용액 : 표준원액을 무처리 시료 추출물을 이용하여 적당한 농도로 혼합, 희석한다(무처리 시료 추출물 90% 이상 포함).
 
  
 5) HLB 카트리지(Hydrophilic-Lipophilic Balance cartridge) : divinylbenzene- N- vinylpyrrolidone copolymer(500 mg) 고정상이 충전되어 있는 일회용 카트리지(용량 6 mL) 또는 이와 동등한 것
 
  
 6) 기타시약 : 잔류농약 시험용 또는 특급
 
  
 마. 시험용액의 조제
 
  
 1) 추출
 시료 10 g(두류 5 g)을 정밀히 달아 200 mL 둥근바닥플라스크에 넣고( 곡류 및 두류 등 건조시료의 경우 물 10 mL를 넣고 30분간 방치) 1 N 염산 100 mL를 가한 뒤 환류냉각기를 부착하여 2시간 가열한다. 상온에서 냉각시킨 후 여과지가 깔려있는 부흐너깔때기로 흡인 여과한 뒤 원심분리관에 10 mL를 넣고 3% 암모니아수를 이용하여 pH 4～5로 맞춘다. ※지방성 시료(곡류, 두류 등)의 경우 미리 아세토니트릴로 포화시킨 헥산 20 mL를 넣고 10분간 강하게 흔들어 섞은 후 4℃, 4,000 G에서 10분간 또는 이와 동등한 조건에서 원심분리하여 수용액 층을 취하고 이를 2회 반복한다.
 
  
 2) 정제
 HLB 카트리지를 메탄올 5 mL와 물 5 mL를 차례로 넣어 2～3 방울/초의 속도로 유출시켜 버린다. 고정상 상단이 노출되기 전에 ‘1) 추출’로부터 얻은 추출물 전량을 카트리지 상단에 넣어 1～2 방울/초의 속도로 유출시켜버리고, 10% 메탄올 5mL로 유출시켜 버린 후, 고정상 상단이 노출되기 전에 메탄올 5 mL를 넣고 용출하여 받는다. 정제된 용액을 멤브레인 필터(Nylon, 0.2 μm)로 여과한 후 시험용액으로 한다.
 
  
 바. 시험조작
 
  
 1) 액체크로마토그래프 분석조건
 
  
 가) 컬럼 : C18계 역상 컬럼 또는 이와 동등한 것
 
  
 나) 컬럼 온도 :40℃
 
  
 다) 이동상
 
  
 (1) 이동상 A : 0.1% 포름산 함유 아세토니트릴
 
  
 (2) 이동상 B : 5 mM 포름산암모늄 및 0.1% 포름산 함유 물
 
  
 (3) 농도구배조건
 
  
 
   
 
    
 
     
 
 시간(분)
 
 
     
 
 A(%)
 
 
     
 
 B(%)
 
 
    
 
    
 
     
 
 0.0
 
 
     
 
 10
 
 
     
 
 90
 
 
    
 
    
 
     
 
 3.0
 
 
     
 
 10
 
 
     
 
 90
 
 
    
 
    
 
     
 
 5.0
 
 
     
 
 40
 
 
     
 
 60
 
 
    
 
    
 
     
 
 5.1
 
 
     
 
 90
 
 
     
 
 10
 
 
    
 
    
 
     
 
 7.0
 
 
     
 
 90
 
 
     
 
 10
 
 
    
 
    
 
     
 
 7.1
 
 
     
 
 10
 
 
     
 
 90
 
 
    
 
    
 
     
 
 10.0
 
 
     
 
 10
 
 
     
 
 90
 
 
    
 
   
 
  
 
  
 라) 이동상 유속 : 0.3 mL/분
 
  
 마) 주입량 :2 μL
 
  
 2) 질량분석기 분석조건
 
  
 가) 이온화 방법 : ESI positive-ion mode
 
  
 나) Capillary voltage : 1.7 kV
 
  
 다) Collision gas : 아르곤(Ar)
 
  
 라)액체크로마토그래프-질량분석기 분석을 위한 특성이온
 
  
 
   
 
    
 
     
 
 분석성분
 
 (Compound)
 
 
     
 
 분자량
 
 (MW)
 
 
     
 
 관측질량
 
 (Exact mass)
 
 
     
 
 선구이온
 
 (Precursor ion,m/z)
 
 
     
 
 생성이온(Product ion,m/z)
 
 
     
 
 충돌에너지
 
 (Collision energy, eV)
 
 
    
 
    
 
     
 
 피독사덴 M4
 
 (Pinoxaden M4)
 
 
     
 
 332.4
 
 
     
 
 332.1
 
 
     
 
 333
 
 
     
 
 3031)
 
 
     
 
 13
 
 
    
 
    
 
     
 
 101
 
 
     
 
 26
 
 
    
 
    
 
     
 
 315
 
 
     
 
 12
 
 
    
 
   
 
  
 
  
 1)정량이온
 
  
 3) 검량선 작성
 표준용액을 농도별로 일정량 취하여 액체크로마토그래프-질량분석기에 각각 주입하여 얻은 크로마토그램상의 각 피크 높이 또는 면적 값으로 검량선을 작성한다.
 
  
 4) 표준품의 크로마토그램
 
  
 
 그림 1. 액체크로마토그래프-질량분석기에서 표준품의 크로마토그램 예시.
 피녹사덴 M4(5.3분)
 * 분석기기 : LC(WatersⓇAcquity UPLC), MS/MS(WatersⓇXevo TQ-S),
 컬럼(Unison UK-C18, 2.1 mm I.D. × 100 mm L., 3.0 μm)
 
  
 5) 정량한계
 0.01 mg/kg
 
  
 사. 정량시험위 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크가 표준용액 피크의 머무름 시간과 일치할 때 피크 높이 또는 면적을 검량선에 대입하여 정량하고, 피녹사덴 M4의 잔류량에 환산계수 1.20[(피녹사덴의 분자량(400.5)/피녹사덴 M4의 분자량(332.4)]을 곱하여 피녹사덴으로 한다.
 
  
 아. 확인시험액체크로마토그래프-질량분석기상의 머무름 시간과 특성이온으로 피녹사덴 대사산물(M4)을 확인한다.