2.2.2.7 비타민D
 
  
가. 액체크로마토그래프(육방전환밸브시스템)/자외부검출기 또는 액체크로마토그래프/질량분석기에 의한 정량
 
  
1) 시험법 적용범위 
 영아용 조제식 및 성장기용 조제식, 조제유류 등에 적용한다. 
 
  
2) 분석원리 
 
 
  
시료를 비누화하여 헥산으로 추출하고 그 추출물을 역상 분배형 칼럼을 이용한 육방전환밸브시스템으로 분리하여 264 nm 파장에서 자외부검출기로 정량하는 방법 또는 액체크로마토그래프/질량분석기로 정량하는 방법이다.
 
  
3) 장치 
 
 
  
가) 액체크로마토그래프(육방전환밸브시스템)/자외부검출기(LC/UV)
 
  
나) 액체크로마토그래프/질량분석기(LC-MS/MS)
 
  
4) 시약 및 시액 
 
 
  
가) 증류수: 크로마토그래프용 혹은 이와 동등한 것
 
  
나) 헥산, 메탄올: 액체크로마토그래프용 혹은 이와 동등한 것
 
  
다) 수산화칼륨, 피로갈롤, 페놀프탈레인, 무수황산나트륨: 특급시약 또는 이와 동등한 것
 
  
5) 표준용액의 조제 
 
 
  
가) 표준원액: 비타민D2와 비타민D3각각 100 mg을 메탄올 100 mL에 녹여 조제한다.(1,000 μg/mL)
 
  
나) 표준용액: 표준원액을 이동상으로 적절히 희석하여 표준용액으로 한다.
 
  
6) 시험용액의 조제 
 
 
  
검체가 고체인 경우에는 분쇄기 등으로 잘게 마쇄하여 비타민D를 2 IU(0.05 μg)이상 함유한 검체를 비누화 플라스크에 정밀히 취한다. 고체시료의 경우, 물 3 mL로 충분히 녹인 후, 피로갈롤․에탄올(1→10)용액 40 mL를 가하여 약하게 진탕 혼합한다. 수산화칼륨(9→10) 10 mL를 가하고, 환류냉각기를 부착하여 끓는 물에서 중탕으로 30분간 가열하여 비누화한다. 즉시 실온으로 냉각하고 갈색 분액깔때기로 옮긴 후, 헥산 50 mL를 가하여 10분간 강하게 진탕 혼합한다. 침전이 생기면 이것이 가라앉을 때까지 방치하여 헥산층을 250～300 mL 새로운 분액깔때기로 옮긴다. 50 mL 헥산 추출을 2회 더 반복하여 이전의 추출용매와 합하고 1N 수산화칼륨용액 100 mL를 가하여 15초간 강하게 진탕한다. 이를 방치하여 분리하고(헥산층은 투명하지 않아도 된다) 혼탁한 물층을 버린다. 헥산층에 0.5N 수산화칼륨용액 40 mL를 가하여 진탕한 후 물층을 다시 버린다. 헥산층을 세척하여 세척액이 페놀프탈레인시액으로 알칼리의 반응을 나타내지 않을 때까지 수회 세척한다. 세척 시 매회 15초간 격렬하게 진탕한다. 수세한 헥산층을 무수황산나트륨으로 탈수하여 갈색 플라스크로 옮기고 무수황산나트륨을 헥산 10 mL로 2회 세척한 후 탈수한 헥산용매와 합하고 이를 40℃이하에서 감압농축한다. 잔류물에 메탄올 5 mL를 가하여 녹여 이를 막 여과지(membrane filter)(PTFE 0.45 um)로 여과하여 시험용액으로 한다.
 
  
7) 시험방법 
 
 
  
가) 육방전환밸브를 이용한 액체크로마토그래프 조건
 
  
(1) 칼럼 
 
 
  
(가) 전처리칼럼: Capcellpak MF C8SG 80(4.6 mm × 150 mm, 5 μm) 또는 이와 동등한 것
 
  
(나) 농축칼럼: Capcellpak C18UG 120V(2.0 mm × 35 mm, 5 μm) 또는 이와 동등한 것
 
  
(다) 분석칼럼: Cadenza CD-C18(1.5 mm × 250 mm, 3 μm) 또는 이와 동등한 것
 
  
(2) 이동상 
 
 
  
(가) 전처리칼럼 이동상: 80%(v/v) 메탄올
 
  
(나) 분석칼럼 이동상: 96%(v/v) 메탄올
 
  
(3) 유속 
 
 
  
(가) 전처리칼럼 이동상: 300 μL/min
 
  
(나) 분석칼럼 이동상: 90 μL/min
 
  
(4) 육방전환밸브의 조작 
 
 
  
전처리칼럼에서 비타민D의 피크 용출시간을 확인하고 농축을 위한 육방전환밸브의 조작시간을 설정한다.
 
  
(5) 주입량: 100 μL 
 
 
  
(6) 검출기: 자외부(UV) 검출기(264 nm) 
 
 
  
나) 액체크로마토그래프/질량분석기의 측정조건
 
  
(1) 액체크로마토그래프 조건 
 
 
  
(가) 칼럼: C18(2.1 × 100 mm, 1.7 µm) 또는 이와 동등한 것
 
  
(나) 이동상: 5 mM 초산암모늄/메탄올(5/95)
 
  
(다) 이동상유량: 0.45 mL/min
 
  
(라) 칼럼온도: 40℃
 
  
(마) 주입량: 1 μL
 
  
(2) 질량분석기 조건 
 
 
  
(가) Ionization: ESI positive
 
  
(나) Source temperature: 120 ℃
 
  
(다) Collision gas: N2(질소 또는 비활성기체)
 
  
(라) Capillary voltage: 3.5 kV
 
  
(마) 질량분석기 분석을 위한 이온
 
  
 
   
 
    
 
     
 
성분
 
 
     
 
Precursor ion(m/z)
 
 
     
 
Fragment ion(m/z)
 
 
    
 
    
 
     
 
비타민D2
 
 
     
 
397
 
 
     
 
107, 105, 91
 
 
    
 
    
 
     
 
비타민D3
 
 
     
 
385
 
 
     
 
107, 105, 79
 
 
    
 
   
 
  
 
  
다) 검량선 작성
 
  
검량곡선 표준용액을 액체크로마토그래프 또는 액체크로마토그래프/질량분석기에 각각 주입하여 얻어진 크로마토그램 상의 각 피크의 넓이를 구하여 검량선을 작성한다.
 
  
라) 표준용액 및 시험용액의 크로마토그램
 
  
(1) 액체크로마토그래프(육방전환밸브시스템)/자외부검출기 
 
 
   
  
(2) 액체크로마토그래프/질량분석기 
 
 
  
 
   
 
    
 
     
 
 
 
     
 
 
 
    
 
    
 
     
 
그림 2. 비타민D3표준용액(100µg/L) 및 시험용액의 크로마토그램
 
 
    
 
    
 
     
 
 
 
     
 
 
 
    
 
    
 
     
 
그림 3. 비타민D2표준용액(100µg/L) 및 시험용액의 크로마토그램
 
 
    
 
   
 
  
 
  
8) 정성시험 
 
 
  
위의 조건에서 얻어진 크로마토그램 상의 피크는 어느 측정조건에서도 표준용액 피크의 머무름 시간과 일치하여야 한다.
 
  
9) 정량시험 
 
 
  
정성시험과 똑같은 조건에서 얻어진 시험결과에 의해 피크 면적법에 따라 정량한다.
 
  
가) 계산방법
 
  
 
   
 
    
 
     
 
비타민 D2또는 D3함량(µg/100 g) =
 
 
     
 
C ×
 
 
     
 
(a × b)
 
 
     
 
× 100
 
 
    
 
    
 
     
 
S
 
 
    
 
   
 
  
 
  
C: 시험용액 중의 비타민 D의 농도(μg/mL)
 
  
a: 시험용액의 전량(mL)
 
  
b: 희석배수
 
  
S: 시료 채취량(g)
 
  
※ 비타민D의 함량은 비타민D2와 비타민D3를 구분하여 계산하고 합한 값으로 한다.
 
  
비타민D 1 μg = 40 IU