2.2.2.10 판토텐산
 
  
 가. 고속액체크로마토그래프에 의한 정량
 
  
 1) 장치
 
  
 액체크로마토그래프 : 자외부검출기를 사용한다.
 
  
 2) 시약 및 시액
 
  
 가)20 mM KH2PO4：KH2PO42.7 g을 증류수에 녹이고 인산으로 pH 2.1로 조절한 후 전량을1 L가 되게 한다.
 
  
 나) 표준용액의 조제
 
  
 판토텐산(D-pantothenic acid, hemicalcium salt)을 20 mM KH2PO4에 녹여 표준원액(100 μg/mL)을 조제하고, 표준원액을 증류수로 적당량 희석하여 표준용액을 만든다.
 
  
 3) 시험용액의 조제
 
  
 검체 적당량을 취하여 분쇄기를 이용하여 잘게 부순 후 적당량의 20mM 인산완충용액을 가하여 30분간 초음파장치로 추출한 후 50 mL로 맞추고, 3,000 rpm에서 원심분리하여 상등액을 0.45 μm 막 여과지(membrane filter)로 여과하여 시험용액으로 한다.
 
  
 4) 시험방법
 
  
 가) 고속액체크로마토그래프의 조건
 
  
 (1) 칼럼：역상 분배형(C18 또는 이와 동등한 것, 1.5 mm×250 mm, 5 μm)
 
  
 (2) 이동상：A- 20mM potassium phosphate(pH 2.1) B-20mN potassium phosphate/ACN(80/20) A：B(96：4)의 혼합액으로 37분간 흘려보낸 후 B 용액으로 10분간 세척한다.
 
  
 (3) 유속：120 μL/분
 
  
 (4) 검출기：자외부(UV) 검출기(200nm)
 
  
 5) 정량시험
 
  
 시험용액 및 표준용액을 각각 10 μL씩 주입하여 앞의 조건에서 시험한다. 표준용액 피크의넓이 또는 높이에 의해 구한 검량선을 사용하여 시험용액의 판토텐산의 농도(μg/mL)를 구하고, 다음의 식에 의하여 검체중 판토텐산의 함량(mg/100 g)을 구한다.
 
  
 가) 계산방법
 
  
 
   
 
    
 
     
 
 판토텐산(mg/100 g) =
 
 
     
 
 S ×
 
 
     
 
 a×b
 
 
     
 
 ×
 
 
     
 
 100
 
 
     
 
 ×
 
 
     
 
 219.23
 
 
    
 
    
 
     
 
 검체량(g)
 
 
     
 
 1,000
 
 
     
 
 238.27
 
 
    
 
   
 
  
 
  
 S：시험용액중의 판토텐산의 농도(μg/mL)
 
  
 a：시험용액의 전량(mL)
 
  
 b：시험용액의 희석배수
 
  
 219.23 : 판토텐산의 분자량
 
  
 238.27 : 판토텐산 칼슘의 분자량
 
  
 나. 고속액체크로마토그래프/질량분석기에 의한 정량
 
  
 1) 시험법 적용범위
 영아용조제식, 성장기용조제식 및 조제유류 등에 적용한다.
 
  
 2) 분석원리
 
  
 식품 중의 판토텐산을 1% 초산을 함유한 5% 아세토니트릴로 추출한 후 질량분석기가 부착된 액체크로마토그래프로 분석한다.
 
  
 3) 장치
 
  
 액체크로마토그래프 : 질량분석기
 
  
 4) 시약 및 시액
 
  
 가) 20 mM 개미산암모늄: 개미산암모늄 0.63 g을 증류수에 녹이고 전량을 1 L가 되게 한다.
 
  
 나) 표준용액의 조제
 
  
 판토텐산(D-pantothenic acid, hemicalcium salt) 10 mg을 100 mL 갈색부피플라스크에 넣고 증류수로 용해 및 정용하여 표준원액(100 μg/mL)을 조제하고, 표준원액을 증류수로 적당량 희석하여 표준용액을 만든다.
 
  
 다) 기타시약: 잔류농약 시험용 또는 HPLC용
 
  
 5) 시험용액의 조제
 
  
 균질화한 검체 약 0.5 ∼ 1.5 g을 정밀히 취하여 50 mL 갈색부피플라스크에 넣고 1% 초산을 함유한 5% 아세토니트릴 30 mL를 첨가 후 혼합한다. 이 용액을 65℃ 항온수조에서 10분간 반응시킨 후 실온에서 냉각 후 1% 초산을 함유한 5% 아세토니트릴을 넣어 정용한다. 약 1분간 혼합 후 시험용액 일부를 취하여 원심분리관에 넣고 3,500 × g에서 15분간 원심분리한다. 상등액을 취하여 증류수로 희석하고 0.45 μm 막 여과지(membrane filter)로 여과하여 시험용액으로 한다.
 
  
 6) 시험방법
 
  
 가) 액체크로마토그래프/질량분석기의 측정조건
 
  
 (1) 칼럼: UPLC HSS T3(2.1 mm × 100 mm, 1.8 μm) 또는 이와 동등한 것
 
  
 (2) 이동상
 
  
 ① 이동상 A: 10 mM 개미산암모늄
 
  
 ② 이동상 B: 아세토니트릴
 
  
 
   
 
    
 
     
 
 시간(분)
 
 
     
 
 이동상 A(%)
 
 
     
 
 이동상 B(%)
 
 
    
 
    
 
     
 
 0.0
 
 
     
 
 95
 
 
     
 
 5
 
 
    
 
    
 
     
 
 1.0
 
 
     
 
 65
 
 
     
 
 35
 
 
    
 
    
 
     
 
 2.0
 
 
     
 
 45
 
 
     
 
 55
 
 
    
 
    
 
     
 
 2.1
 
 
     
 
 5
 
 
     
 
 95
 
 
    
 
    
 
     
 
 3.0
 
 
     
 
 5
 
 
     
 
 95
 
 
    
 
    
 
     
 
 3.1
 
 
     
 
 95
 
 
     
 
 5
 
 
    
 
    
 
     
 
 5.0
 
 
     
 
 95
 
 
     
 
 5
 
 
    
 
   
 
  
 
  
 (3) 이동상 유속: 0.3 mL/min
 
  
 (4) 칼럼온도: 40℃
 
  
 (5) 주입량: 1 µL
 
  
 (6) 이온화: ESI positive
 
  
 (7) 질량분석기 분석을 위한 이온
 
  
 
   
 
    
 
     
 
 성분
 
 
     
 
 Precursor ion(m/z)
 
 
     
 
 Fragment ion(m/z)
 
 
    
 
    
 
     
 
 판토텐산
 
 
     
 
 220
 
 
     
 
 90, 184, 202
 
 
    
 
   
 
  
 
  
 나) 검량선 작성
 
  
 표준용액을 농도별로 일정량 취하여 액체크로마토그래프/질량분석기에 주입한다. 얻어진 크로마토그램 상의 각 피크 높이 또는 피크 면적을 구하여 검량선을 작성한다.
 
  
 7) 정성시험
 
  
 위의 조건에서 얻어진 크로마토그램상의 피크는 어느 측정조건에서도 표준용액 피크의 머무름 시간과 일치하여야 한다.
 
  
 8) 정량시험
 
  
 정성시험과 똑같은 조건에서 얻어진 시험결과에 의해 피크면적법에 따라 정량한다.
 
  
 가) 계산방법
 
  
 
   
 
    
 
     
 
 판토텐산(mg/100 g) =
 
 
     
 
 S ×
 
 
     
 
 a×b
 
 
     
 
 ×
 
 
     
 
 100
 
 
     
 
 ×
 
 
     
 
 219.23
 
 
    
 
    
 
     
 
 검체량(g)
 
 
     
 
 1,000
 
 
     
 
 238.27
 
 
    
 
   
 
  
 
  
 S: 시험용액중의 판토텐산의 농도(μg/mL)
 
  
 a: 시험용액의 전량(mL)
 
  
 b: 시험용액의 희석배수
 
  
 219.23: 판토텐산의 분자량
 
  
 238.27: 판토텐산 칼슘의 분자량