2.2.2.11 비타민B12 
  
 가. 액체크로마토그래프(육방전환밸브시스템)/자외부검출기 또는 액체크로마토그래프/질량분석기에 의한 정량
 
  
 1) 시험법 적용범위
 
  
 특수용도식품 등에 적용한다.
 
  
 2) 분석원리
 
  
 식품 중의 비타민B12를 추출용매로 추출한 후 면역친화성컬럼으로 정제하여 자외부검출기 또는 질량분석기가 부착된 액체크로마토그래프로 분석한다.
 
  
 3) 장치
 
  
 가) 액체크로마토그래프(육방전환밸브시스템)/자외부검출기
 나) 액체크로마토그래프/질량분석기
 다) 정제용 컬럼: 비타민B12용 면역친화성컬럼(Immunoaffinity column)(회수율 및 재현성 등이 검증된 것)
 
  
 4) 시약 및 시액
 
  
 가) 5 mM 인산이수소칼륨 용액: 인산이수소칼륨 0.68 g을 증류수에 녹이고 전량을 1 L가 되게 한다.
 나) 0.2 M 초산나트륨 용액: 초산나트륨 16.41 g을 증류수에 용해시킨 후 초산을 이용하여 pH 4로 맞춘 후 증류수에 녹여 1 L로 정용한다.
 다) 1%(w/v) 시안화나트륨 용액: 시안화나트륨 1 g을 증류수에 녹여 100 mL로 정용한다.
 라) 20 mM 개미산암모늄: 개미산암모늄 1.26 g을 증류수에 녹이고 전량을 1 L가 되게 한다(질량분석기로 분석시 사용)
 마) 표준용액의 조제
 비타민B12(Cyanocobalamin)을 5 mM 인산이수소칼륨 용액에 녹여 표준원액(100 μg/mL)을 조제하고, 표준원액을 증류수로 적당량 희석하여 표준용액을 만든다.
 
  
 바) 기타시약: 잔류농약 시험용 또는 HPLC용
 
  
 5) 시험용액의 조제
 
  
 가) 추출
 균질화한 검체 약 1∼5 g을 달아 갈색원심분리관에 취하고 0.2 M 초산나트륨 용액 49.5 mL와 1% 시안화나트륨 0.5 mL를 넣고 상온에서 10분간 초음파 추출한 다음 100℃ 수욕 상에서 30분간 추출하고 상온으로 냉각한다. 이어서 여과지(Whatman No.2 또는 이와 동등한 것)로 여과한 것을 추출액으로 한다.
 
  
 나) 정제
 냉장보관 된 정제용 컬럼은 실온에 30분 방치한 후 컬럼 내부의 완충용액을 완전히 제거한다. 증류수 3 mL를 정제용 컬럼에 주입하여 활성화시킨 후 추출액 9 mL를 정제용 컬럼에 주입하여 추출액 중 비타민B12을 정제용 컬럼에 흡착시킨다. 이어서 증류수로 3 mL씩 3회 주입하여 불순물을 제거하고 공기를 주입하여 컬럼 내에 남아 있는 용액을 제거한다. 정제용 컬럼에 흡착된 비타민B12를 메탄올 3 mL로 시험관에 용출시킨다. 용출액을 70℃에서 질소로 건고시키고 잔류물에 증류수 0.5 mL를 가하여 녹인 것을 시험용액으로 한다.
 
  
 6) 시험방법
 
  
 가) 액체크로마토그래프(육방전환밸브시스템)의 측정조건
 
  
 (1) 칼럼
 
  
 (가) 전처리컬럼：Capcellpak MF C8 (4.6 mm×150 mm, 5 μm) 또는 이와 동등한 것
 
  
 (나) 농축컬럼：Capcellpak MG C18 (2.0 mm×35 mm, 5 μm) 또는 이와 동등한 것
 
  
 (다) 분석컬럼：Capcellpak UG C18 (1.5 mm×250 mm, 5 μm) 또는 이와 동등한 것
 
  
 (2) 이동상
 
  
 (가) 전처리컬럼 이동상: 5 mM 인산이수소칼륨 용액
 
  
 (나) 분석컬럼 이동상: 5 mM 인산이수소칼륨 용액/메탄올(80:20, v/v)
 
  
 (3) 유속
 
  
 (가) 전처리컬럼 이동상：500 μL/min
 
  
 (나) 분석컬럼 이동상：120 μL/min
 
  
 (4) 육방전환밸브의 조작
 
  
 전처리 칼럼에서 비타민B12의 피크 용출시간을 확인하고 농축을 위한 육방전환밸브의 조작시간을 설정한다.
 
  
 (5) 주입량: 400 μL
 
  
 (6) 검출기: 자외부검출기(550 nm)
 
  
 나) 액체크로마토그래프/질량분석기의 측정조건
 
  
 (1) 액체크로마토그래프 조건
 
  
 (가) 컬럼: ACQUITY UPLCⓇBEH(2.1 mm x 50 mm, 1.7 µm) 또는 이와 동등한 것
 
  
 (나) 이동상
 ① 이동상 A: 20 mM 개미산암모늄
 ② 이동상 B: 아세토니트릴
 
  
 
   
 
    
 
     
 
 시간(분)
 
 
     
 
 이동상 A(%)
 
 
     
 
 이동상 B(%)
 
 
    
 
    
 
     
 
 0.0
 
 
     
 
 95
 
 
     
 
 5
 
 
    
 
    
 
     
 
 0.7
 
 
     
 
 95
 
 
     
 
 5
 
 
    
 
    
 
     
 
 1.2
 
 
     
 
 80
 
 
     
 
 20
 
 
    
 
    
 
     
 
 1.6
 
 
     
 
 80
 
 
     
 
 20
 
 
    
 
    
 
     
 
 1.7
 
 
     
 
 20
 
 
     
 
 80
 
 
    
 
    
 
     
 
 3.7
 
 
     
 
 20
 
 
     
 
 80
 
 
    
 
    
 
     
 
 3.8
 
 
     
 
 95
 
 
     
 
 5
 
 
    
 
    
 
     
 
 6.0
 
 
     
 
 95
 
 
     
 
 5
 
 
    
 
   
 
  
 
  
 (다) 이동상 유속: 0.4 mL/min
 
  
 (라) 컬럼온도: 35℃
 
  
 (마) 주입량: 10 µL
 
  
 (2) 질량분석기 조건
 
  
 (가) Ionization: ESI positive
 
  
 (나) Source temperature: 120 ℃
 
  
 (다) Collision gas: N2(질소 또는 비활성기체)
 
  
 (라) Capillary voltage: 3.5 kV
 
  
 (다) Collision gas: N2(질소 또는 비활성기체)
 
  
 (마) 질량분석기 분석을 위한 이온
 
  
 
   
 
    
 
     
 
 성분
 
 
     
 
 Precursor ion(m/z)
 
 
     
 
 Fragment ion(m/z)
 
 
    
 
    
 
     
 
 비타민B12
 
 
     
 
 678
 
 
     
 
 147, 359
 
 
    
 
   
 
  
 
  
 다) 검량선 작성
 
  
 표준용액을 농도별로 일정량 취하여 액체크로마토그래프(육방전환밸브시스템)/자외부검출기 또는 액체크로마토그래프/질량분석기에 각각 주입한다. 얻어진 크로마토그램 상의 각 피크 높이 또는 피크 면적을 구하여 검량선을 작성한다.
 
  
 7) 정성시험
 
  
 위의 조건에서 얻어진 크로마토그램상의 피크는 어느 측정조건에서도 표준용액 피크의 머무름 시간과 일치하여야 한다.
 
  
 8) 정량시험
 
  
 정성시험과 똑같은 조건에서 얻어진 시험결과에 의해 피크면적법에 따라 정량한다.
 
  
 가) 계산방법
 
  
 
   
 
    
 
     
 
 비타민B12 함량(µg/100 g)
 
 
     
 
 =
 
 
     
 
 C
 
 
     
 
 ×
 
 
     
 
 (a × V2 × b)
 
 
     
 
 × 100
 
 
    
 
    
 
     
 
 (S × V1)
 
 
    
 
   
 
  
 
  
 C: 검량곡선에 얻은 시험용액의 농도(μg/mL)
 a: 시료 추출에 사용된 용액의 부피(mL)
 V1: 정제용 컬럼에 주입한 추출액의 부피(mL)
 V2: 정제 후 시험용액의 최종부피(mL)
 b: 시험용액의 희석배수
 S: 검체 채취량(g)