7.1.2.14글리포세이트(Glyphosate), 글루포시네이트[Glufosinate(ammonium)]
 
  
가. 시험법 적용범위곡류, 서류, 두류, 과일류, 채소류 등 식품에 적용한다.
 
  
나. 분석원리시료를 물로 추출한 후 메틸에스테르화 하고 액체크로마토그래프-질량분석기로 분석한다.
 
  
다. 장치
 
  
1) 액체크로마토그래프-질량분석기(LC-MS/MS) 
 
 
  
라. 시약 및 시액
 
  
1) 용매 : 잔류농약 시험용 또는 특급 
 
 
  
2) 물 : 3차 증류수 또는 이와 동등한 것 
 
 
  
3) 표준원액 : 글리포세이트, 글루포시네이트 및 글루포시네이트 대사산물 2종 
 *의 표준품을 각각 물에 녹여 1,000 mg/L가 되게 한다. 
 
  
*글루포시네이트대사산물 :N-아세틸 글루포시네이트(N-acetyl-glufosinate), 3-MPP(3-[hydroxy(methyl)phosphinoyl]propionic acid)
 
  
4) 표준용액 : 표준원액을 물에 녹여 적당한 농도로 각각 혼합, 희석한다. 
 
 
  
5) 유도체 시약 
 
 
  
가) 50 mM 사붕산나트륨 용액 : 사붕산나트륨을 물에 녹여 50 mM이 되게 한다.
 
  
나) 4 mM FMOC-Cl 용액 : 9-플루오레닐메틸 클로로포메이트(Fluorenylmethyl Chloroformate)을 아세토니트릴에 녹여 4 mM이 되게 한다(4℃ 냉장보관).
 
  
6) 기타시약 : 잔류농약 시험용 또는 특급 
 
 
  
7) 특이사항 : 유리에 흡착하는 성질이 있으므로 모든 시험과정은 폴리프로필렌으로 된 용기를 사용한다. 
 
 
  
마. 시험용액의 조제시료 10 g을 정밀히 달아 폴리프로필렌(PP) 튜브에 취하여 물 35 mL를 넣고 30분간 흔들어 섞어 추출한 뒤 4,000G에서 5분간 또는 이와 동등한 조건에서 원심분리한다. 상층액을 다른 폴리프로필렌(PP) 튜브에 옮기고 물을 넣어 최종 부피가 40 mL가 되게 한다. 이 추출액 중 1 mL만 취하여 클로로포름 0.5 mL가 담긴 2 mL 폴리프로필렌 튜브에 옮겨 30초간 강하게 흔든 뒤 15,000G에서 5분간 또는 이와 동등한 조건에서 원심분리한다. 상층액 0.5 mL를 5 mL 폴리프로필렌 튜브에 옮겨 물 0.5 mL를 넣고 50 mM 사붕산나트륨 용액 200 μL와 4 mM FMOC-Cl 용액 400 μL를 차례로 넣은 후 50℃에서 30분간 정치하여 층을 분리하고 유도체화 반응을 실시한다. 반응이 끝나면 상온에서 열을 식히고 포름산 10 μL를 넣어 pH를 낮춰준 후 디클로로메탄 0.5 mL를 넣어 섞고 30초간 강하게 흔든 뒤 4,000G에서 5분간 또는 이와 동등한 조건에서 원심분리한다. 상층액 1 mL를 취해 시린지 필터로 여과한 후 시험용액으로 한다.
 
  
바. 시험조작
 
  
1) 액체크로마토그래프-질량분석기 분석조건 
 
 
  
가) 컬럼 : C18(2.1 mm × 100 mm, 2.6 μm) 또는 이와 동등한 것
 
  
나) 컬럼 온도 : 40℃
 
  
다) 이동상
 
  
(1) 이동상 A : 0.1% 포름산 함유 아세토니트릴 
 
 
  
(2) 이동상 B : 0.1% 포름산 함유 물 
 
 (3) 농도구배조건 
  
 
  
 
   
 
    
 
     
 
시간(분)
 
 
     
 
A(%)
 
 
     
 
B(%)
 
 
    
 
    
 
     
 
0.1
 
 
     
 
5
 
 
     
 
95
 
 
    
 
    
 
     
 
5.0
 
 
     
 
90
 
 
     
 
10
 
 
    
 
    
 
     
 
6.0
 
 
     
 
90
 
 
     
 
10
 
 
    
 
    
 
     
 
6.5
 
 
     
 
5
 
 
     
 
95
 
 
    
 
    
 
     
 
10.0
 
 
     
 
5
 
 
     
 
95
 
 
    
 
   
 
  
 
  
라) 이동상 유속 : 0.2 mL/분
 
  
마) 주입량 : 5 μL
 
  
2) 질량분석기 분석조건 
 
 
  
가) 이온화- ESI negative-ion mode : 글리포세이트-FMOC, 글루포시네이트-FMOC- ESI positive-ion mode :N-아세틸 글루포시네이트, 3-MPP
 
  
나) Capillary temperature : 400℃
 
  
다) Spray voltage : 4,500 V
 라) Collision gas : 아르곤(Ar)마) 액체크로마토그래프-질량분석기 분석을 위한 특성이온
  
 
   
 
    
 
     
 
분석성분
 
(Compound)
 
 
     
 
선구이온
 
(Precursor ion,m/z)
 
 
     
 
생성이온(Production,m/z)
 
 
     
 
충돌에너지
 
(Collision energy, eV)
 
 
    
 
    
 
     
 
글리포세이트-FMOC
 
(Glyphosate-FMOC)
 
 
     
 
390
 
 
     
 
168
 
 
     
 
15
 
 
    
 
    
 
     
 
124
 
 
     
 
26
 
 
    
 
    
 
     
 
글루포시네이트-FMOC
 
(Glufosinate-FMOC)
 
 
     
 
402
 
 
     
 
180
 
 
     
 
12
 
 
    
 
    
 
     
 
206
 
 
     
 
16
 
 
    
 
    
 
     
 
N-아세틸 글루포시네이트
 
(N-acethyl glufosinate)
 
 
     
 
224
 
 
     
 
118
 
 
     
 
16
 
 
    
 
    
 
     
 
56
 
 
     
 
32
 
 
    
 
    
 
     
 
3-MPP
 
(3-[hydroxy(methyl)
 
phosphinoyl]propionic acid)
 
 
     
 
153
 
 
     
 
79
 
 
     
 
22
 
 
    
 
    
 
     
 
135
 
 
     
 
13
 
 
    
 
   
 
  
 
  
3) 검량선 작성 
 표준용액을 물에 일정농도로 희석한 다음 시료에 주입하고 시험용액의 조제과정에 따라 시험한 후, 액체크로마토그래프-질량분석기에 각각 주입한다. 이온의 피크 높이 또는 면적을 구하여 검량선(matrix matched calibration curve)을 작성한다. 
 
  
4) 표준품의 크로마토그램 
 
 
  
그림 1. 액체크로마토그래프-질량분석기에서 표준품의 크로마토그램 예시.
 
  
A : 글리포세이트(4.0분), B : 글루포시네이트(4.2분),
 
  
C :N-아세틸 글루포시네이트(1.2분), D : 3-MPP(1.2분)
 
  
5) 정량한계 
 0.05 mg/kg
 
  
사. 정량시험위 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크가 표준용액 피크의 머무름 시간과 일치할 때 피크 높이 또는 면적을 검량선에 대입하여 정량한다.