7.1.2.5 아바멕틴(Abamectin), 밀베멕틴(Milbemectin), 레피멕틴(Lepimectin)
가. 시험법 적용범위곡류, 두류, 과일류, 채소류 등 식품에 적용한다.
나. 분석원리시료를 메탄올로 추출한 후 플로리실 컬럼크로마토그래피로 정제하여 액체크로마토그래프로 분석한다.
다. 장치
1) 액체크로마토그래프-자외선흡광검출기(HPLC-UVD)
2) 액체크로마토그래프-질량분석기(LC-MS)
라. 시약 및 시액
1) 용매 : 잔류농약 시험용 또는 특급
2) 물 : 3차 증류수 또는 이와 동등한 것
3) 표준원액 : 아바멕틴(B1a및 B1b), 밀베멕틴(A3및 A4) 및 레피멕틴(A3및 A4) 표준품을 각각 아세토니트릴에 녹여 500 mg/L가 되게 한다.
4) 표준용액 : 표준원액을 아세토니트릴에 녹여 적당한 농도로 각각 혼합, 희석한다.
5) 플로리실(Florisil) : 컬럼크로마토그래피용 플로리실(60~100 mesh) 130℃에서 하룻밤 가열한 후 데시케이터에서 보관하여 사용한다.
6) 아미노프로필 카트리지(Amino-propyl cartridge) : 아민(1 g) 고정상이 충전되어 있는 일회용 카트리지(용량 6 mL) 또는 이와 동등한 것
7) 기타시약 : 잔류농약 시험용 또는 특급
마. 시험용액의 조제
1) 추출
시료 30 g(곡류, 두류는 20 g)을 정밀히 달아 추출 용기에 넣고(곡류, 두류 등 건조 시료는 물 20 mL를 넣고 2시간 방치) 메탄올 100 mL를 넣어 2~3분간 강하게 흔들어 섞어 추출한다. 이를 여과지가 깔려있는 부흐너깔때기로 흡인 여과하고, 잔류물을 메탄올 40 mL로 씻어 내려 앞의 여과액과 합친다. 합친 여과액을 1 L 용량의 분액깔때기에 옮기고 디클로로메탄 50 mL, 포화염화나트륨용액 50 mL 및 물 450 mL를 넣고 강하게 흔들어 정치하여 층을 분리시킨 후, 디클로로메탄층을 무수황산나트륨에 통과시켜 감압농축플라스크에 받는 과정을 2회 반복한다. 이를 40℃ 이하에서 감압 농축하고, 잔류물을 디클로로메탄 10 mL로 녹인다. ※ 곡류 및 두류 등 지방성 시료의 경우 상기 잔류물을 아세토니트릴포화헥산 50 mL로 녹여 분액깔때기에 옮기고 헥산포화아세토니트릴 50 mL로 2회 분배 추출하여 아세토니트릴층을 40℃ 이하에서 감압 농축하고 디클로로메탄 10 mL에 녹인다.2) 정제
가) 플로리실 정제 : 안지름 11 mm, 길이 400 mm의 유리컬럼에 플로리실 5 g과 무수황산나트륨을 2 cm 높이로 차례로 충전한 후 디클로로메탄 50 mL를 넣어 유출시켜 버린다. 고정상 상단이 노출되기 전에 ‘1) 추출’로부터 얻은 디클로로메탄 용액 10 mL를 고정상 상단에 넣어 유출시켜 버린다. 고정상 상단이 노출되기 전에 에틸아세테이트 : 디클로로메탄(10 : 90) 혼합액 50 mL를 넣어 유출시켜 버리고 다시 메탄올 : 에틸아세테이트(0.5 : 99.5) 혼합액 50 mL를 넣어 용출하여 감압농축플라스크에 받는다. 이 용출액을 40℃ 이하에서 감압 농축한 후 잔류물을 헥산 10 mL로 녹인다.
나) 아민 카트리지 정제 : 미리 헥산 10 mL로 활성화한 아민 카트리지에 상기 헥산 용액을 넣어 유출시켜 버린다. 고정상 상단이 노출되기 전에 톨루엔 5 mL를 넣어 유출시켜 버리고 디클로로메탄 10 mL와 아세톤 : 디클로로메탄(20 : 80) 혼합액 5 mL로 2회 용출하여 받는다. 이 용출액을 40℃ 이하에서 감압 농축하고 잔류물에 물 : 아세토니트릴(30 : 70) 혼합액을 넣어 최종부피 2 mL가 되게 한 후 갈색 바이알(Vial)에 담아 시험용액으로 한다.
바. 시험조작
1) 액체크로마토그래프의 분석조건
가) 컬럼 : C18(4.6 mm × 250 mm, 5 μm) 또는 이와 동등한 것
나) 이동상 : 물과 아세토니트릴(30 : 70)의 혼합액
다) 이동상 유속 : 1 mL/분
라) 컬럼 온도 : 40℃
마) 검출파장 : 245 nm
바) 주입량 : 20 μL
2) 검량선 작성
표준용액을 농도별로 일정량 취하여 액체크로마토그래프에 각각 주입한다. 얻어진 크로마토그램상의 각 피크 높이 또는 면적을 구하여 검량선을 작성한다.3) 표준품의 크로마토그램
그림 1. 액체크로마토그래프에서 표준품의 크로마토그램 예시.
1 : 아바멕틴 B1b(13.0분), 2 : 아바멕틴 B1a(17.0분), 3 : 밀베멕틴 A3(16.9분),
4 : 레피멕틴 A3(19.7분), 5 : 밀베멕틴 A4(22.8분), 6 : 레피멕틴 A4(25.8분)
4) 정량한계
아바멕틴 B 1a(0.02 mg/kg), 아바멕틴 B 1b(0.02 mg/kg), 밀베멕틴 A 3(0.02 mg/kg), 밀베멕틴 A 4(0.02 mg/kg), 레피멕틴 A 3(0.02 mg/kg), 레피멕틴 A 4(0.02 mg/kg)사. 정량시험위 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크가 표준용액 피크의 머무름 시간과 일치할 때 피크 높이 또는 면적을 검량선에 대입하여 정량한다.
아. 확인시험액체크로마토그래프-질량분석기상의 머무름 시간과 질량분석 스펙트럼으로 아바멕틴, 밀베멕틴 및 레피멕틴을 확인한다.
1) 액체크로마토그래프-질량분석기의 분석조건
가) 컬럼 : C18(2.0 mm × 150 mm, 3 μm) 또는 이와 동등한 것
나) 이동상 : 물과 아세토니트릴(30 : 70)의 혼합액※ 레피멕틴은 아래 A 및 B의 이동상(40 : 60)을 사용A : 5 mM 포름산암모늄과 0.1% 포름산 함유 물B : 5 mM 포름산암모늄과 0.1% 포름산 함유 아세토니트릴과 물(90 : 10)의 혼합액
다) 이동상 유속 : 0.4 mL/분
라) 컬럼 온도 : 40℃
마) 주입량 : 2 μL
바) 이온화 : ESI negative-ion mode※ 레피멕틴은 ESI positive-ion mode
사) 분자량 범위 : 300~1,000m/z
아) 액체크로마토그래프-질량분석기 분석을 위한 특성이온
분석성분 (Compound) |
머무름 시간 (분) |
분자량 (MW) |
이온 (m/z) |
아바멕틴 B1b (AbamectinB1b) |
8.0 |
859.0 |
857 |
아바멕틴 B1a (AbamectinB1a) |
9.8 |
873.1 |
871 |
밀베멕틴 A3 (MilbemectinA3) |
10.6 |
528.7 |
527 |
밀베멕틴 A4 (MilbemectinA4) |
13.6 |
542.7 |
541 |
레피멕틴 A3 (LepimectinA3) |
6.0 |
705.8 |
728 |
레피멕틴 A4 (LepimectinA4) |
6.5 |
719.9 |
743 |