- ▶ 제 8. 일반시험법 ▶ 7. 식품 중 잔류농약 시험법 ▶ 7.3 축·수산물의 잔류물질 ▶ 7.3.2 단성분 시험법 (Individual residue method) ▶ 7.3.2.6 메토프렌(Methoprene)
7.3.2.6 메토프렌(Methoprene)
가. 시험법 적용범위
소고기, 돼지고기 등 축산물(지방 포함)에 적용한다.
나. 분석원리
시료를 1% 아세트산 함유 아세톤 : 아세토니트릴(1 : 1) 혼합액으로 추출하고 d-SPE(dispersive-Solid Phase Extraction)로 정제하여 액체크로마토그래프-질량분석기로 분석한다.
다. 장치
1) 액체크로마토그래프-질량분석기(LC-MS/MS)
라. 시약 및 시액
1) 용매 : 잔류농약 시험용 또는 특급
2) 물 : 3차 증류수 또는 이와 동등한 것
3) 표준원액 : 농약 표준품을 아세토니트릴에 녹여 1,000 mg/L가 되게 한다.
4) 표준용액 : 표준원액을 무처리 시료추출물*을 이용하여 적당한 농도로 혼합, 희석한다(무처리 시료추출물 90% 이상 포함).
* 무처리 시료추출물 : 분석대상 농약을 포함하지 않은 시료를 시험용액과 동일한 방법으로 추출, 정제한 것을 말한다.
5) d-SPE : 무수황산마그네슘(MgSO4, anhydrous magnesium sulfate), C18(octadecyl bonded silica), 1차 2차 아민(PSA, Primary Secondary Amine)
6) 기타시약 : 잔류농약 시험용 또는 특급
마. 시험용액의 조제
1) 추출
가) 지방을 제외한 축산물
균질화한 시료 5 g을 정밀히 달아 50 mL 원심분리관에 넣고 1% 아세트산 함유 아세토니트릴 : 아세톤(1 : 1) 혼합액 20 mL를 넣어 10분간 강하게 흔들어 추출한다. 여기에 무수황산마그네슘 6 g과 아세트산나트륨 1.5 g을 넣어 1분간 흔들어 섞은 후 4℃, 4,000 G에서 10분간 또는 이와 동등한 조건에서 원심분리한다. 새로운 15 mL 원심분리관에 상층액을 옮겨 –20℃에서 30분간 방치한 후 -4℃, 4,000 G에서 10분간 또는 이와 동등한 조건에서 원심분리한다.\
나) 고기 중 지방(f)
균질화한 고기류 30～50 g(지방함량이 3 g이 되도록)을 용기에 담고 무수황산나트륨 약 50 g을 넣고 섞은 후 여기에 석유에테르 또는 헥산 150 mL를 넣어 5분간 흔들어 혼합한 후 여과보조제(Celite 545)를 넣은 부흐너깔때기에서 감압 여과한다. 잔류물은 석유에테르 또는 헥산 50 mL로 재추출하여 위의 여과액과 합하고 무수황산나트륨으로 탈수한 후 40℃이하에서 감압하여 용매를 날린다. 지방 2 g을 정밀히 달아 50 mL 원심분리관에 넣고 1% 아세트산 함유 아세토니트릴 : 아세톤(1 : 1) 혼합액 10 mL를 넣어 10분간 흔들어 추출한다. 여기에 무수황산마그네슘 6 g과 아세트산나트륨 1.5 g을 넣어 1분간 혼합한 후 4℃, 4,000 G에서 10분간 또는 이와 동등한 조건에서 원심분리한다. 새로운 15 mL 원심분리관에 상층액을 옮겨 –20℃에서 1시간 방치한 후 –4℃, 4,000 G에서 10분간 또는 이와 동등한 조건에서 원심분리한다.
2) 정제
무수황산마그네슘 500 mg, 1차 2차 아민 125 mg, C18 125 mg이 담긴 15 mL 원심분리관에 ‘1) 추출’로부터 얻은 상층액 5 mL를 넣고 1분간 충분히 혼합한 후 이를 4℃, 4,000 G에서 10분간 또는 이와 동등한 조건에서 원심분리한다. 새로운 15 mL 원심분리관에 상층액 3 mL을 옮겨 40℃이하에서 질소 농축한 후 메탄올 3 mL에 녹여 멤브레인 필터(PTFE, 0.2 μm)로 여과한 것을 시험용액으로 한다.
바. 시험조작
1) 액체크로마토그래프 분석조건
가) 컬럼 : C18계 역상 컬럼 또는 이와 동등한 것
나) 컬럼온도 : 40℃
다) 이동상
(1) 이동상 A : 0.1% 포름산 및 5 mM 포름산암모늄을 함유한 물
(2) 이동상 B : 0.1% 포름산 및 5 mM 포름산암모늄을 함유한 메탄올
(3) 농도구배조건
| 시간(분) | A(%) | B(%) |
| 0.0 | 60 | 40 |
| 1.0 | 60 | 40 |
| 2.0 | 10 | 90 |
| 4.0 | 0 | 100 |
| 7.0 | 0 | 100 |
| 7.1 | 60 | 40 |
| 10.0 | 60 | 40 |
라) 이동상 유속 : 0.2 mL/분
마) 주입량 : 5 μL
2) 질량분석기 분석조건
가) 이온화 방법 : ESI positive-ion mode
나) Capillary voltage : 3.5 kV
다) Collision gas : 아르곤(Ar)
라) 액체크로마토그래프-질량분석기 분석을 위한 특성이온
| 분석성분 (Compound) |
머무름 시간(min) | 분자량 (MW) |
관측질량 (Exact mass) |
선구이온 (Precursor ion, m/z) |
생성이온 (Product ion, m/z) |
충돌에너지 (Collision energy, eV) |
| 메토프렌 (Methoprene) |
4.2 | 310.5 | 310.25 | 311 | 191 1) | 12 |
| 279 | 5 |
3) 검량선 작성
표준용액을 농도별로 일정량 취하여 액체크로마토그래프-질량분석기에 각각 주입하여 얻은 크로마토그램상의 각 피크 높이 또는 면적 값으로 검량선을 작성한다.
4) 표준품의 크로마토그램
그림 1. 액체크로마토그래프-질량분석기에서 표준품의 크로마토그램 예시
* 분석기기 : LC(Agilent Technologies 1290 Infinity Ⅱ), MS/MS(Agilent Technologies 6470 LC/TQ), 컬럼(Agilent Technologies, Poroshell 120 EC C18, 2.1 mm × 50 mm, 1.9 μm)
5) 정량한계
0.01 mg/kg
사. 정량시험
위 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크가 표준용액 피크의 머무름 시간과 일치할 때 피크 높이 또는 면적을 검량선에 대입하여 정량한다. 시험용액의 농도가 검량선 범위를 초과하는 경우 무처리 시료 추출물로 희석하여 검량선 범위 내에서 정량한다.
아. 확인시험
액체크로마토그래프-질량분석기상의 머무름 시간과 특성이온으로 대상 농약을 확인한다.
