2.1.4.3 식이섬유

가. 효소-중량법

1) 시험법 적용범위

가공식품, 과일 및 채소 등에 적용한다.

2) 분석원리

건조된 시료 두 개를 준비하고 이를 내열성 α-아밀라아제(Thermophile α-amylase), 프로테아제, 아밀로글루코시다제 효소로 연속적으로 분해하여 전분과 단백질을 제거한다. 이때 10% 이상의 지방을 함유한 식품은 건조 전에 지방을 제거하여 시험한다. 총 식이섬유(TDF) 정량은 효소분해물에 녹아 있는 식이섬유를 에탄올로 처리하여 침전시켜 여과하고 에탄올과 아세톤으로 세척한 후, 건조하여 그 무게를 확인한다. 물불용성 식이섬유(IDF)는 효소분해물을 여과하여 잔사(residue)를 따뜻한 물로 세척하고 그 무게를 확인하여 정량한다. 수용성식이섬유(SDF)는 IDF의 전처리과정에서 얻은 여과액과 세척액을 합하여 에탄올로 침전시킨 후 여과하여 잔류물을 건조하고 무게를 확인하여 정량한다. 총 식이섬유, 물불용성 및 수용성식이섬유 함량계산 시 잔사(residue)의 무게 중 단백질 및 회분량은 보정해준다.

3) 장치

가) 비커 : 400 또는 600 mL Tall-form.

나) 유리여과기 : 기공 40～60 μm (ASTM 기준)의 용융 유리디스크가 있는 Pyrex 60 mL(Corning No. 36060 Buchner 또는 이와 동등한 것). 525℃에서 하룻밤 동안 회화하고 회화로 온도가 130℃까지 떨어지면 유리여과기를 상온에서 방냉한 후, 2% 세척액에 1시간 동안 담근 후 물로 씻고 증류수로 헹군 다음 아세톤 15 mL을 사용하여 마지막으로 세척하고 바람을 불어 대기 중 방치하여 건조시킨다. 건조된 유리여과기에 규조토 약 1.0 g을 넣고 130℃에서 항량한 후, 데시케이터에서 1시간 동안 실온에 방냉하여 규조토를 포함한 유리여과기의 무게를 0.1 mg까지 칭량하여 기록한다.

다) 진공장치 : 조절장치를 갖춘 진공펌프나 아스피레이터, 1L 용량의 여과용 가지달린 플라스크 및 여과용 플라스크에 사용하는 고무 아답터

라) 진탕 항온수조 : 98 ± 2℃까지 가온 및 온도의 유지가 가능하고 60℃로 일정하게 온도를 유지할 수 있는 것.

마) 저울 : 0.1 mg 까지 측정이 유효한 것.

바) 회화로 : 525 ± 5℃ 유지할 수 있는 것.

사) 오븐 : 105℃와 130 ± 3℃ 유지할 수 있는 것.

아) 데시케이터 : 실리카겔이나 이와 동등한 건조제가 있는 것. 건조제는 필요 시 130℃에서 하룻밤 동안 건조하여 사용한다.

자) pH meter : 온도 보정이 되고 pH 4, 7, 10 버퍼용액으로 표준화 된 것.

차) 피펫 : 일회용 팁이 사용가능한 것으로 용량 100～300 uL 및 5 mL.

카) 디스펜서 : 15 ± 0.5 mL용 3개(78% ethanol, 95% ethanol, acetone용), 40 ± 0.5 mL용 1개(버퍼용)

타) 자석 교반기 및 자석 교반막대

4) 시약 및 시액

가) 증류수 : 3차 증류수

나) 에탄올 수용액

(1) 85% : 1 L 정용 플라스크에 95% 에탄올 895 mL을 넣고 물을 표선까지 채워 조제한다.

(2) 78% : 1 L 정용 플라스크에 95% 에탄올 821 mL을 넣고 물을 표선까지 채워 조제한다.

다) 내열성 α-아밀라아제(Thermophile α-amylase) 용액 : 아래의 효소분해능을 만족하거나 5)효소활성 검증 시 회수율을 만족하는 것으로 글리세롤이 없을 것, 0～5℃에서 보관하며 사용한다(Sigma사 Catalog No. A 3306 또는 이와 동등한 것)

※ (1) 가용성 전분을 기질로 하는 Nelson/Somogyi reducing sugar 방법에 기초하는 것 : 10,000 ± 1,000 units/mL(1 unit: pH 6.5, 40℃에서 1분당 1 μmole reducing sugar equivalents를 만드는 데 필요한 효소의 양)

(2) 내열성 α-글루코시다제의 존재 시 기질로 p-nitrophenyl -maltosaccharide를 사용하는 Ceralpha방법에 기초한 것 : 3,000±300 Ceralpha unit(알파아밀라아제 단위)s/mL
(1 unit: pH 6.5, 40℃에서 1분당 1 μmole p-nitrophenol을 만드는 데 필요한 효소의 양)

라) 프로테아제 효소용액: 아래의 효소분해능을 만족하거나 5)효소 활성 검증 시 회수율을 만족하는 것으로써 0～5℃에서 보관하고 MES/TRIS 완충액으로 희석하여 50 mg/mL로 사용 시 조제한다(Sigma사 Catalog No. P 3910 또는 이와 동등한 것)

※ (1) Casein assay: 300～400 units/mL (1 unit: pH 8.0, 40℃에서 가용성 casein으로부터 1분당 1 μmole tyrosine equivalents를 가수분해하는데 필요한 효소의 양) ; 7～15 units/mg (1 unit: pH 7.5, 37℃에서 casein으로부터 1분당 1.0 μmole tyrosine에 해당하는 색 (Folin-Ciocalteau reagent)을 내는데 필요한 효소의 양)

(2) Azo-casein assay : 300～400 units/mL (1 unit endo-peptidase activity: pH 8.0, 40℃에서 가용성 casein으로부터 1분당 1 μmole tyrosine equivalents를 가수분해하는데 필요한 효소의 양)

마) 아밀로글루코시다제 용액 : 아래의 효소분해능을 만족하거나 5)효소 활성 검증 시 회수율을 만족하는 것으로써 0～5℃에서 보관하며 사용한다. 글리세롤이 없을 것(Sigma사 Catalog No. A 9913 또는 이와 동등한 것)

※ (1) Starch/glucose oxidase-peroxidase 방법 : 2,000～3,300 units/mL (1 unit: pH 4.5, 40℃에서 1분당 1 μmole 포도당을 만드는 데 필요한 효소의 양)

(2) PNPBM (p-nitophenyl β-maltosidase) 방법 : 130～200 units/mL (1 unit: β-글루코시다제가 과량 존재할 때, 40℃에서 1분당 p-nitrophenyl β-maltosidase가 1 μmole p-nitrophenol을 만드는 데 필요한 효소의 양).

바) 규조토(Diatomaceous earth) : 산세척한 것(Sigma사 Catalog No. C 8656 또는 Fisher Scientific사 Catalog No. C-211, 산세척 또는 그와 동등한 것)

사) 세척용액 : 실험실용 액체 계면활성 세정제(International products사의 Micro 혹은 그와 동등한 것)를 2% 수용액으로 조제한다.

아) MES : 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid(Sigma사 Catalog No. M-8250 또는 이와 동등한 것)

자) TRIS : Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Sigma사 Catalog No. T-1503 또는 이와 동등한 것)

차) MES-TRIS 완충용액(0.05M MES, 0.05M TRIS, 24℃에서 pH 8.2) : MES 19.52 g과 TRIS 12.2 g을 물 1.7 L에 녹인 후 6M 수산화나트륨용액을 가하여 pH 8.2로 조절한 후, 물을 가하여 2 L가 되게 조제한다(24℃에서 pH 8.2로 조절하는 것이 중요하다. 만약 버퍼용액의 온도가 20℃이면 pH 8.3으로 조절하고, 28℃이면 pH 8.1로 조절한다).

카) 염산용액(0.561M) : 1 L 정용 플라스크에 물 약 700 mL를 넣고 6M HCl 93.5 mL을 혼합한 후 증류수로 표선까지 채워 조제한다.

5) 효소 활성 검증

효소 활성은 표 1.의 표준시료를 가. 효소-중량법에 따라 분석 시 총 식이섬유 함량에 대한 회수율을 만족하여야 한다. 이때 펙티나제, 헤미셀룰라제, β-글루카나제의 오염이 존재하지 않는지를 팩틴, 아라비노갈락탄, β-글루칸으로 확인하여야 한다. 개봉한 효소는 최대 6개월 마다 활성을 검증하여 사용한다.

표 1. 표준시료에 대한 식이섬유 회수율 만족범위

표준시료	활성검증 대상효소	표준시료 사용량, g	회수율, %
Wheat starch1)	내열성 α-아밀라아제 (Thermophile α-amylase) + 아밀로글루코시다제	1.0	0～1
Corn starch2)	내열성 α-아밀라아제 (Thermophile α-amylase) + 아밀로글루코시다제	1.0	0～1
Casein3)	프로테아제 효소	0.3	0～1
Pectin4)	팩티나제	0.1	95～100
Arabinogalactan5)	헤미셀룰라제	0.1	95～100
β-Glucan6)	β-글루카나제	0.1	95～100

1)Sigma사 Catalog No. S 1514 혹은 이와 동등한 것

2)Sigma사 Catalog No. S 2388 혹은 이와 동등한 것

3)Sigma사 Catalog No. C 7906 혹은 이와 동등한 것

4)Sigma사 Catalog No. P 7536 혹은 이와 동등한 것

5)Sigma사 Catalog No. A 9788 혹은 이와 동등한 것

6)Sigma사 Catalog No. G 7391 혹은 이와 동등한 것

6) 시험용액의 조제

가) 시료 균질화

건조된 시료의 총 식이섬유를 확인하기 위해서 시료를 균질화한 후, 70℃ 진공오븐에서 하룻밤 동안 건조시킨다. 시료를 데시케이터에서 방냉하고 0.3～0.5 mm mesh가 되도록 건식 분쇄한다. 열처리를 할 수 없는 시료의 경우 분쇄하기 전에 냉동건조한다. 지방함량이 높다면 (10% 이상) 분쇄하기 전에 석유에테르로 탈지한다(시료 1 g당 25 mL 씩 3번 처리). 지방제거로 인한 무게 손실을 기록하고 이에 대한 총 식이섬유 함량(%)을 보정한다. 분석 전까지 건조-분쇄된 시료는 마개가 있는 병에 담아 데시케이터에서 보관한다(만약 시료의 지방함량을 모른다면, 식이섬유를 측정하기 전에 탈지한다). 당 함량이 높은 제품은 식이섬유 측정 전에 85% 에탄올(10 mL/g)로 2～3회 추출한 다음 상등액을 제거하고 40℃에서 하룻밤 동안 건조한다.

나) 효소분해

4개의 400 mL(또는 600 mL) tall-form 비커에 시료 1.000 ± 0.005 g을 정밀히 달아 2개의 검체(M1, M2)를 준비하고 2개의 공시험(B1, B2)을 준비한다. 이에 MES-TRIS 완충용액 40 mL씩 가하여 시료가 뭉치지 않고 완벽하게 분산될 때까지 자석 교반하여 혼합한다. 저속으로 혼합하면서, 내열성 α-아밀라아제(Thermophile α-amylase) 용액 50 μL을 첨가한다. 비커를 알루미늄박으로 덮은 후 95∼100℃ 수욕에서 15분 동안 계속 교반하면서 반응한다. 수욕의 온도가 95℃에 도달할 때부터 시작한다(보통 총 35분이면 충분하다). 수욕에서 모든 비커를 꺼내어 60℃로 식힌다. 알루미늄박을 제거하고 비커의 벽 또는 바닥에 생긴 겔 형태의 내용물을 시약스푼으로 긁어내어 용액 속에 분산시킨다. 비커 벽과 시약스푼을 10 mL의 물로 씻어준다. 프로테아제 효소용액 100 μL을 각 비커에 첨가한다. 알루미늄박으로 비커를 덮고 60±1℃ 수욕에서 30분간 계속해서 교반하여 반응시킨다. 수욕의 온도가 60℃에 도달한 후 반응을 시작한다. 알루미늄박을 제거한 후 비커를 잘 교반하면서 0.561M HCl 5 mL을 넣어준다. 60℃에서 1M NaOH, 1M HCl를 사용하여 용액을 pH 4.0～4.7로 조정한다(※ 참고 : pH는 낮은 온도에서 올라가기 때문에 60℃에서 pH를 조정하고 확인하는 것이 중요하다. 대부분의 곡류, 채소 시료의 경우, pH 조정이 없이도 pH조건을 만족할 수 있으므로 이전에 확인된 시료의 경우, pH 조정 과정을 생략할 수 있다. 단, 공시험의 pH를 예비단계로 확인하고 만약 공시험의 pH가 올바른 범위를 벗어난다면, 반드시 시료의 pH를 점검한다). 비커를 교반하면서 아미노글루코시다제 용액 300 μL를 첨가하고 알루미늄박으로 덮은 후 60±1℃ 수욕에서 교반하면서 30분간 항온한다. 수욕의 온도가 60℃에 도달할 때 반응을 시작한다.

7) 총 식이섬유(TDF) 함량 측정

실온 기준 225 mL 95% 에탄올을 60℃에서 효소 분해된 각각의 시험용액에 가한다. 이때 에탄올과 시험용액의 부피 비율은 4 : 1이 되어야 한다. 수욕에서 비커를 꺼내어 알루미늄박으로 덮고 실온에서 1시간 침전시킨다. ☆미리 규조토를 넣고 무게를 칭량한 유리여과기에 78% 에탄올 15 mL를 가하여 규조토를 분산시킨 후 흡인여과하여 규조토층이 고르게 형성되도록 한다. 에탄올 처리된 효소 분해물을 준비된 유리여과기로 여과하고 78% 에탄올이 들어있는 세척병과 고무재질의 시약스푼를 이용하여 비커의 잔류물을 유리여과기로 옮긴다. 이때 효소분해물에 엷은 막이 생성될 경우, 시약스푼으로 생성된 막을 깨고 여과한다. 진공을 유지하면서 78% 에탄올, 95% 에탄올, 아세톤 순으로 각각 15 mL씩 2회 잔류물을 씻는다. ★105℃에서 잔류물이 남아있는 유리여과기를 하룻밤 동안 건조시키고, 데시케이터에서 1시간 동안 방냉하여 항량한 후, 식이섬유 잔류물 및 규조토를 포함한 유리여과기의 무게를 0.1 mg 단위까지 칭량한다. 미리 칭량하여 확인한 규조토를 포함한 유리여과기의 무게를 빼서 식이섬유의 무게를 계산한다. 같은 두개의 시료 중 하나는 1.1.3.1 총질소 및 조단백질에 따라 단백질 함량을 측정한다. 이때 질소계수는 6.25를 사용한다. 다른 하나는 1.1.2. 회분에 따라 회분량을 확인한다. 이때 525℃에서 5시간 이상 회화하고 0.1 mg 단위까지 칭량한다. 미리 칭량하여 확인한 규조토를 포함한 유리여과기의 무게를 빼서 회분의 무게를 결정한다.

8) 물불용성 식이섬유(IDF) 측정

미리 규조토를 넣어 항량하여 준비한 유리여과기에 물 3 mL을 가하여 규조토를 적시고 분산시킨 후 흡인여과하여 규조토층을 고르게 한다. 이에 시험용액 조제에서 얻어진 효소분해물을 유리여과기를 통해 여과용 플라스크로 여과한다. 비커를 세척하면서 잔류물을 70℃ 물 10 mL로 2회 세척한다. 여액과 물 세척액을 합치고, 미리 무게를 칭량한 600 mL 비커로 옮겨 9) 수용성 식이섬유 측정에 사용한다. 잔류물은 곧바로 78% 에탄올, 95% 에탄올 그리고 아세톤의 순으로 각각 15 mL씩 2회 세척한다(주의: 잔류물의 세척을 즉시 하지 않을 경우, IDF 값이 높아질 수 있다). 7) 총식이섬유 함량 측정 과정의 ★ 이하에 따라 IDF의 무게를 계산한다.

9) 수용성 식이섬유(SDF) 측정

8) 물불용성 식이섬유 측정에서 600 mL 비커로 옮긴 여액과 물 세척액의 무게를 확인하여 부피를 확인하고 미리 60℃로 가열된 95% 에탄올을 측정한 부피의 4배량을 가한다. 이때 60℃ 에탄올의 일부를 이용하여 여과용 플라스크에 남은 여액과 물 세척액을 세척한다. 여과액과 물 세척액에 에탄올을 4배량 가하기 위한 방법으로 물을 첨가하여 여과액과 물 세척액의 무게를 80 g으로 맞추고, 60℃의 95% 에탄올 320 mL을 가할 수도 있다. 그 후, 상온에서 1시간 침전시킨 후, 7) 총 식이섬유 함량 측정 중 ☆이하에 따라 SDF의 함량을 측정한다.

10) 식이섬유 함량의 계산

※ 총 식이섬유 함량은 7) 총 식이섬유(TDF) 함량 측정을 독립적으로 수행하여 결정하거나 8) 물불용성 식이섬유(IDF) 측정 및 9) 수용성 식이섬유(SDF) 측정에서 구한 IDF와 SDF의 합으로 결정할 수 있다.

가) 공시험 함량 (B, mg) 측정: B = [(B1R + B2R) / 2] - PB- AB

․B1R, B2R: 공시험 2반복에 대한 잔사(residue)의 무게 (mg)

․PB: 공시험(B1)의 단백질 무게 (mg)

․AB: 공시험(B2)의 회분 무게 (mg)

나) 식이섬유 함량(DF, g/100g) 측정: [IMG NAME : EQUATION1898215621]

․M1R, M2R: 검체 2반복의 잔사(residue) 무게 (mg)

․P: 잔사(residue)(M1R) 중 단백질 무게 (mg)

․A: 잔사(residue)(M2R) 중 회분 무게 (mg)

․B: 공시험 함량 (mg)

․M1, M2: 검체의 무게 (mg)

나. 액체크로마토그래프를 이용한 수용성 식이섬유의 정량

1) 시험법 적용범위

난소화성 말토덱스트린 등 알코올 수용액에 의해 일부만이 침전되는 식이섬유를 함유하는 식품

2) 분석원리

난소화성 말토덱스트린(난소화성 말토덱스트린(RMD, resistant maltodextrin)) 등을 함유한 식품에 인산완충액을 이용한 효소-중량법을 적용하여 에탄올에 의해 침전되는 고분자의 난소화성 말토덱스트린과 같은 수용성 식이섬유(HMWSDF)를 확인하고 에탄올에 녹는 저분자의 난소화성 말토덱스트린과 같은 수용성 식이섬유(LMWSDF)를 탈염하여 농축한 후, 액체크로마토그래프로 확인하는 방법이다. 이 방법에서 총 식이섬유는 물불용성 식이섬유(IDF) 및 HMWSDF와 액체크로마토그래프로 확인한 LMWSDF의 합으로 계산되어진다. 즉 효소-중량법으로 구한 식이섬유의 함량에 알코올에 녹는 수용성 식이섬유의 함량을 합하여 총 식이섬유의 함량으로 한다.

3) 장치

가) 저울 : 0.1 mg 까지 측정이 유효한 것.

나) 비커 : 500 mL Tall-form

다) 진탕 항온수조 : 98±2℃까지 가온하여 온도 유지가 가능하고 60℃로 일정하게 온도를 유지할 수 있는 것

라) 유리여과기 : 기공 40～60 μm(ASTM 기준)의 용융 유리디스크가 있는 Pyrex 60 mL(Corning No. 36060 Buchner 또는 이와 동등한 것). 525℃에서 하룻밤 동안 회화하고 회화로 온도가 130℃까지 떨어지면 유리여과기를 상온에서 방냉한 후, 2% 세척액에 1시간 동안 담근 후 물로 씻고 증류수로 헹군 다음 아세톤 15 mL을 사용하여 마지막으로 세척하고 바람을 불어 건조시킨다. 건조된 유리여과기에 규조토 약 1.0 g을 넣고 130℃에서 항량한 후, 데시케이터에서 1시간 동안 실온에 방냉하여 규조토를 포함한 유리여과기의 무게를 0.1 mg까지 칭량하여 기록한다.

마) 유리 또는 플라스틱 칼럼관 : 이온교환수지를 채우기 위한 것으로 40∼70 cm × 15 mm 내경의 칼럼관

바) 유리막대 : 20 cm 길이로 끝을 열처리한 것

사) 일회용 주사기 : 10 mL

아) 파스퇴르 피펫, 10 mL 정용피펫

자) 저울 : 4,000 g 용량

차) 테프론 막대 : 비커의 침전물을 모을 수 있는 것

카) 용량플라스크 : 10, 50, 250 및 1,000 mL

타) 감압농축기

4) 시약 및 시액

가) 증류수 : 3차 증류수

나) 에탄올 : 95% Technical grade

다) 에탄올 수용액(78%) : 1 L 정용 플라스크에 95% 에탄올 821 mL을 넣고 물을 표선까지 채워 조제한다.

라) 인산수소나트륨(Na2HPO4) 및 인산이수소나트륨(NaH2PO4)

마) 인산 완충용액(0.08M, pH 6.0): 무수 인산수소나트륨 1.4 g (또는 2수화물 1.753 g)과 9.68 g 인산이수소나트륨·1수화물 (또는 2수화물 10.94 g)을 700 mL 증류수에 녹인 후 증류수를 가하여 1 L로 조제한다. 이때 pH를 확인한다.

바) 액체크로마토그래프 머무름 시간 확인용 표준물질: 저분자의 난소화성 말토덱스트린에 해당하는 올리고당[DP(Degree of polymerization)≥3]을 포함한 DE(Dextrose equivalent) 25 또는 16.5～19.5의 말토덱스트린(Sigma사 419699 또는 이와 동등한 것)

사) 내열성 α-아밀라아제(Thermophile α-amylase) 용액: Termamyl 120 또는 이와 동등한 것, 글리세롤이 없을 것, 0～5℃에서 보관하며 사용한다(Sigma사 Catalog No. A 3403 또는 이와 동등한 것).

아) 프로테아제 효소용액: 2.1.4.3. 가. 4)시약 및 시액 라)의 효소분해능을 만족하는 것으로써 0～5℃에서 보관하고 인산 완충용액으로 희석하여 10 mg/mL로 사용 시 조제한다(Sigma사 Catalog No. P 3910 또는 이와 동등한 것).

자) 아밀로글루코시다제 용액 : 2.1.4.3. 가. 4)시약 및 시액 마)의 효소분해능을 만족하는 것으로써 0～5℃에서 보관하며 사용한다. 글리세롤이 없을 것(Sigma사 Catalog No. A 9913 또는 이와 동등한 것)

차) 규조토(Diatomaceous earth) : 산세척한 것(Sigma사 Catalog No. C 8656 또는 Fisher Scientific사 Catalog No. C-211, acid washed 또는 이와 동등한 것)

카) 각 시료의 탈염을 위한 이온교환수지

(1) m-1 : 25 g Amberlite IRA-67(OH-type) 또는 이와 동등한 것

(2) m-2 : 25 g Amberlite 200 CT(HG)H(H-type) 또는 이와 동등한 것

각 시험 용액의 분석을 위해서 유리칼럼에 상기 2종의 수지를 잘 혼합하여 충진한다.

․총 이온교환능 : 1.74 meq/mL

․유효 이온교환능(R-H 교환능) : 1.6 meq/mL(min.)

․상기 2종의 수지를 혼합하여 충진하기 전 각 수지를 증류수로 세척하고 세척액의 pH가 m-1은 7～8.8, m-2는 4～7의 값이 되도록 한다.

※ Amberlite 200 CT(HG)H가 없을 경우, Amberlite 200 (Na-type) 또는 Amberlite 200CT를 'H-type'으로 전환하여 사용한다. 이를 위해 Amberlite 200(Na-type) 600 mL(500 g)을 유리 또는 플라스틱 칼럼관(100 cm × 40 mm id)에 채우고 2배 부피의 증류수를 이용하여 60 mL/min의 속도로 세척하고 2배 부피의 10% 염산용액(1→3 w/w)을 재차 60 mL/min의 속도로 흘려준 후 수지의 3배 부피에 해당하는 증류수를 이용하여 60 mL/min의 속도로 세척하여 염산을 제거한다. 3～6배의 부피에 해당하는 증류수를 120 mL/min의 속도로 재차 세척하고 세척액의 pH가 4～7인지 확인하여 염산용액의 세척이 제대로 이루어졌는지 확인하여 사용한다.

타) 수산화나트륨 수용액(0.274 M) : NaOH 11 g을 증류수 약 700 mL에 녹인 후 증류수를 가하여 1 L로 조제한다.

파) 염산용액(0.325M) : 1 L 정용 플라스크에 1M HCl 325 mL을 넣고 증류수를 가하여 1 L로 조제한다.

하) 글리세롤 표준용액(10 mg/mL) : 비커에 글리세롤(순도 99.5% 이상) 10 g을 달아 1L 정용플라스크로 물로 씻어 옮겨 표선까지 채워 조제한다.

갸) 덱스트로즈-글리세롤 반응계수 확인용 표준용액(100 mg/mL) : 비커에 글리세롤(순도 99.5% 이상) 10 g을 달아 100 mL 정용플라스크에 물로 씻어 옮겨 표선까지 채워 조제한다.

냐) 황산 암모늄

댜) 덱스트로즈 : 액체크로마토그래프용, 순도 99.5% 이상

5) 시험용액의 조제

가) 시료 균질화

제8. 2. 2.1. 2.1.4. 2.1.4.3 식이섬유 가. 효소-중량법 6) 시험용액 조제 가)와 같이 준비한다. 당함량이 높은 시료의 경우, LMWSDF의 손실을 고려하여 85% 에탄올 세척과정은 생략한다.

나) 효소분해

4개의 500 mL tall-form 비커에 시료 1.000 ± 0.005 g을 정밀히 달아 2개의 검체(M1, M2)를 준비하고 2개의 공시험(B1, B2)을 준비한다. 이에 인산 완충용액 50 mL씩 가하고 초음파를 이용하여 시료가 뭉치지 않고 완벽하게 분산시킨다. 내열성 α-아밀라아제(Thermophile α-amylase) 용액 100 μL을 첨가한다. 비커를 알루미늄박으로 덮은 후 95℃ 수욕에서 30분 동안 계속 진탕하면서 반응시킨다. 수욕의 온도가 95℃에 도달할 때부터 시작한다(보통 총 35분이면 충분하다). 수욕에서 모든 비커를 꺼내어 실온으로 식힌다. 알루미늄박을 제거하고 비커에 벽 또는 바닥에 생긴 겔 형태의 내용물을 시약스푼으로 긁어내어 용액 속에 분산시킨다. 비커 벽과 시약스푼을 10 mL의 물로 씻어준다. 0.275M 수산화나트륨용액으로 pH를 7.5±0.1로 조정한 후, 프로테아제 효소용액 0.5 mL를 각 비커에 첨가한다. 알루미늄박으로 비커를 덮고 60℃ 수욕에서 30분간 계속해서 교반하여 반응시킨다. 수욕의 온도가 60℃에 도달한 후 반응을 시작한다. 실온으로 용액을 식힌 후, 알루미늄박을 제거한 후 비커를 잘 교반해주면서 0.325M HCl로 용액의 pH를 4.5±0.2로 조정한다. 비커를 교반해주면서 아미노글루코시다제 용액 0.3 mL를 첨가하고 알루미늄박으로 덮은 후 60℃ 수욕에서 지속적으로 흔들면서 30분간 항온한다. 수욕의 온도가 60℃에 도달할 때 반응을 시작한다.

6) 물불용성 식이섬유(IDF) 및 HMWSDF의 함량 측정

60℃로 가열한 95% 에탄올을 60℃ 수욕 상의 효소분해된 각각의 시험용액에 가한다. 이때 에탄올과 시험용액의 부피의 비율은 4 : 1이 되어야 한다. 수욕에서 비커를 꺼내어 알루미늄박으로 덮고 실온에서 하룻밤 침전시킨다. 미리 규조토를 넣고 무게를 칭량한 유리여과기에 있는 78% 에탄올 15 mL을 가하여 규조토를 분산시킨 후 흡인여과하여 규조토층이 고르게 형성되도록 한다. 에탄올 처리된 효소 분해물을 준비된 유리여과기로 여과하고 78% 에탄올이 들어있는 세척병과 고무재질의 시약스푼를 이용하여 비커의 잔류물을 유리여과기로 옮긴다. 이때 효소분해물에 엷은 막이 생성될 경우, 시약스푼으로 생성된 막을 깨고 여과한다. 진공을 유지하면서 20 mL 78% 에탄올 3회, 10 mL 95% 에탄올로 2회, 10 mL 아세톤으로 2회씩 잔류물을 씻어낸다. 105℃에서 잔류물이 남아있는 유리여과기를 하룻밤 건조시키고, 유리여과기를 데시케이터에서 1시간 동안 항량한 후, 식이섬유 잔류물 및 규조토를 포함한 유리여과기의 무게를 0.1 mg 단위까지 칭량한다. 미리 칭량하여 확인한 규조토를 포함한 유리여과기의 무게를 빼서 식이섬유의 무게를 계산한다. 같은 두개의 시료 중 하나는 1.1.3.1 총질소 및 조단백질에 따라 단백질 함량을 측정한다. 이때 질소계수는 6.25를 사용한다. 다른 하나는 1.1.2 회분에 따라 회분량을 확인한다. 이때 525℃에서 5시간 이상 회화하고 0.1 mg 단위까지 칭량한다. 미리 칭량하여 확인한 규조토를 포함한 유리여과기의 무게를 빼서 회분의 무게를 결정한다.

7) 여액 회수 및 탈염

6)의 여액을 감압농축기로 농축하여 완전 증발건조시키고 잔류물을 소량의 물로 녹인 후, 이를 50 mL 정용플라스크에 정량적으로 옮긴다. 이에 글리세롤 표준용액 10 mL을 넣고 증류수로 표선까지 채워 50 mL로 조제한다. 이를 Amberlite IRA-67(m-1) 및 Amberlite 200CT(HG)H(m-2) 각 25 g을 완전히 혼합하여 채운 유리칼럼(75 cm × 15 mm id)에 통과시키고 이후, 250 mL 증류수로 칼럼을 통해 세척하며 추출한다. 이때 유속은 0.8 mL/min으로 조정한다.

이온교환 칼럼을 통과한 초기 용출액부터 250 mL를 모아 정량적으로 500 mL 둥근 플라스크에 옮기고 완전 건고될 때 까지 감압농축한다. 이를 10 mL 정용플라스크로 증류수를 이용하여 정량적으로 옮겨 10 mL로 조제한 후 10 mL 일회용 주사기에 옮겨 0.2 μm 맴브레인 필터로 여과하여 액체크로마토그래프용 시험용액으로 한다.

8) 시험방법

가) 액체크로마토그래프의 측정조건

(1) 분석칼럼 : TSK-GEL G2500PWXL, 7.8 mm id × 30 cm를 연속하여 2개를 연결한 것 또는 이와 동등한 것

(2) 가드 칼럼 : TSK guard column PWXL, 6.0 mm id × 4 cm 또는 이와 동등한 것

(3) 칼럼온도 : 80℃

(4) 이동상 : 증류수

(5) 유속 : 0.5 mL/min

(6) 주입량 : 20 μL

(7) 검출기 : 시차굴절검출기(Refractive Index detector, RI), 40℃ 유지

나) 난소화성 말토덱스트린(RMD, resistant maltodextrin)과 액체크로마토그래프 반응이 동등한 덱스트로즈로 반응계수 결정

난소화성 말토덱스트린(RMD, resistant maltodextrin)의 RI 검출기의 반응에 대한 평가와 표준화를 위해 글리세롤 표준물질을 사용한다. LC 분석에서 RI 검출기에서 얻은 난소화성 말토덱스트린(RMD, resistant maltodextrin)의 피크면적은 덱스트로즈와 동등하며 내부표준물질인 글리세롤의 피크면적과 덱스트로즈의 농도에 따른 피크면적을 비교한다. 이렇게 작성된 검량곡선으로부터 시험용액 중 난소화성 말토덱스트린(RMD, resistant maltodextrin)의 함량을 계산하는데 사용할 반응계수를 결정한다.

동량의 글리세롤과 3개 농도 수준으로 덱스트로즈를 100 mL 정용플라스크에 각각 넣은 3개의 용액을 준비한다. 이를 위해 0.5, 1.0, 2.0 g의 덱스트로즈를 3개의 구분된 100 mL 정용플라스크에 정확히 칭량하여 넣고 덱스트로즈-글리세롤 반응계수 확인용 표준용액 10 mL을 각 정용 플라스크에 첨가한 후 증류수를 채워 100 mL로 조제한다. 조제된 3개의 표준용액 20 μL를 액체크로마토그래프에 주입하여 각 크로마토그래프에서 덱스트로즈와 글리세롤의 피크면적을 확인하여 글리세롤의 피크면적에 대한 덱스트로즈 피크면적 비(y-축)와 글리세롤 함량에 대한 덱스트로즈 함량 비(x-축)을 비교하여 얻어진 기울기의 역수로부터 아래의 식과 같이 반응계수를 구한다.

반응계수(Rf) = 1/[(PA-dex/PA-gly)×(Wt-gly/Wt-dex)]

PA-dex : 덱스트로즈 피크면적

PA-gly : 글리세롤 피크면적

Wt-dex : 표준용액 중 덱스트로즈 함량

Wt-gly : 표준용액 중 글리세롤 함량

다) 액체크로마토그래프의 크로마토그램

[IMG NAME : PIC1898215622]

[IMG NAME : PIC1898215624]

그림 1. 표준용액 및 시험용액의 크로마토그램

9) 식이섬유 함량 계산

※ 총 식이섬유 함량(TDF)은 %(IDF+HMWSDF)와 LMWSDF의 평균 함량(%ALMWSDF)을 합하여 계산한다.

가) (IDF + HMWSDF)의 함량 계산

(1) 공시험 함량 (B, mg) 측정 : B = [(B1R +B2R) / 2] - PB- AB

․B1R, B2R : 공시험 2반복에 대한 잔사(residue)의 무게 (mg)

․PB: 공시험(B1)의 단백질 무게 (mg)

․AB: 공시험(B2)의 회분 무게 (mg)

(2) (IDF + HMWSDF) 평균 함량(g/100g) 측정 : [IMG NAME : EQUATION1898215626]

․M1R, M2R : 검체 2반복의 잔사(residue) 무게 (mg)

․P : 잔사(residue)(M1R) 중 단백질 무게 (mg)

․A : 잔사(residue)(M2R) 중 회분 무게 (mg)

․B : 공시험 함량 (mg)

․M1, M2 : 검체의 무게 (mg)

나) LMWSDF의 평균 함량

(1) LMWSDF(mg) 측정 :

LMWSDF	=	PAS_LMWSDF×WtS_gly×Rf
		PAS_gly

․PAS_LMWSDF : 시험용액 중 LMWSDF(DP≥3)의 피크면적

․PAS_gly : 시험용액 중 글리세롤의 피크면적

․WtS_gly : 시험용액에 첨가한 글리세롤의 무게(mg)

․Rf : 덱스트로즈-글리세롤 반응계수

(2) 각 시료의 LMWSDF의 함량(g/100g) 측정

%LMWSDF	=	LMWSDF×100
		SW

․SW : 시료의 무게(mg)

(3) LMWSDF의 평균 함량(g/100g)

%ALMWSDF	=	%LMWSDF+%LMWSDF'
		2

․%LMWSDF, %LMWSDF' : 각 시료의 LMWSDF의 함량(g/100g)