8.3.91 콜리스틴(Colistin)

1) 시험법 적용범위

축‧수산물 등에 적용한다.

2) 분석원리

검체 중 콜리스틴을 1N 염산(수산물의 경우,5% 메탄올성 0.5%개미산 혼합용액)으로 추출하고 HLB(Hydrophilic-Lipophilic Balance)카트리지로 정제한 후 액체크로마토그래프/질량분석기로 분석한다.

3) 장치

액체크로마토그래프/질량분석기(LC-MS/MS)

4) 시약 및 시액

가) 용매: 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것

나) 물: 3차 증류수 또는 이와 동등한 것

다) 표준원액: 콜리스틴 표준품(A와 B의 혼합물)을 정밀히 달아 50% 메탄올 용액에 녹여 100mg/L이 되게 한다.

라) 표준용액: 표준원액을 1% 개미산 메탄올 용액으로 희석하여 적당한 농도가되게 한다.

마) 5% 메탄올성 0.5% 개미산 혼합용액: 1,000 mL 용량플라스크에5 mL의 개미산을 넣고 5% 메탄올 용액을 표시선까지 채운다.

바) HLB(Hydrophilic lipophilic balance) 카트리지(6 mL, 200 mg) 또는 이와 동등한 것

사) 기타시약: 특급

아) 기구: 사용하는 모든 용기는 폴리프로필렌 재질 또는 이와 동등한 것

5) 시험용액의 조제

가) 축산물

균질화한 검체 2 g을 50 mL 폴리프로필렌 원심분리관에 취하고㉠ 1 N염산용액 5 mL를 넣어 추출한 후 4℃12,000G에서 10분간원심분리한다.㉠의 과정을 2회 반복하여상층액을 합하여추출액으로 한다.미리 메탄올 5 mL와 물 5 mL로 활성화시킨 HLB카트리지에 추출액을 흡착시키고 물 5 mL로 세척한 후, 1%개미산을 함유하는 메탄올 용액 4 mL로 용출한다. 이 용액을 균질화한 후0.2 μm 막 여과지(PTFEmembrane filter)로 여과하여 시험용액으로 한다.

나) 수산물

균질화한검체 2 g을 50 mL 폴리프로필렌 원심분리관에 취하고 ㉡5% 메탄올성 0.5% 개미산 혼합용액 5 mL를넣어 가볍게 진탕한후4℃12,000G에서 10분간 원심분리한다.㉡의 과정을 2회 반복하여상층액을합하여추출액으로 한다.미리 메탄올 5 mL와 물 5 mL로 활성화 시킨HLB카트리지에 추출액을 흡착시키고 물 5 mL로 세척한 후, 1%개미산을 함유하는 메탄올 용액 4 mL로 용출한다. 이 용액을 균질화한 후0.2 μm 막 여과지(PTFEmembrane filter)로 여과하여 시험용액으로 한다.

6) 시험조작

가) 액체크로마토그래프 측정조건

(1)칼럼: C18(XSELECT, 2.1 × 150 mm, 3.5 μm) 또는 이와 동등한 것

(2) 칼럼온도: 40℃

(3) 이동상

(가) 이동상 A: 암모늄포메이트/개미산/물(1/2.5/497.5, v/v/v)

(나) 이동상 B: 1% 개미산 함유 아세토니트릴 용액

시간(분)	이동상 A(%)	이동상 B(%)
0	100	0
1	100	0
8	10	90
9	10	90
9.5	100	0
12	100	0

(4) 유속: 0.3 mL/분

(5) 주입량: 5 μL

나) 질량분석기 조건

(1) Ionization: ESI(Positive)

(2) Capillary temperature: 500℃

(3) Capillary voltage: 3.5 kV

(4) Collision gas: 아르곤(Ar)

(5) 분석대상물질의 조건

물질명 (Compounds)	머무름 시간(분)	분자량	선구이온 (Precursor ion, m/z)	생성이온 (Product ion, m/z)	충돌에너지 (Collision energy, eV)
콜리스틴 A (Colistin A)	4.65	1169.48	585.3	100.99	30
				227.09	20
				569.58	16
콜리스틴 B (Colistin B)	4.47	1155.45	578.35	100.99	30
				202.01	13
				576.53	16

※밑줄 표시 되어 있는 것은 정량이온이며 그 외 이온들은 정성이온임

※각 생성이온(Production)에 대한 질량분석기의 기기조건은 사용기기의최적값으로 변경하여 사용할 수 있으며, 제시된 이외의 생성이온도 적용이 가능함

7) 정성시험

가) 정성

위의 조건에서 얻어진 크로마토그램상의 피크는 표준물질 피크의머무름 시간과 일치하여야 한다. 또한 표준용액과 시험용액을 각각 질량분석기에 주입하였을 때 선구이온(Precursor ion) 및 생성이온(Product ion)이 일치하여야 하고, 표준용액과 시험용액의생성이온간반응세기의 비율(Response ratio)을 비교하여그 비율은 주1)과 일치하여야 한다.

주1)생성이온간 반응세기의 비율 허용범위

이온간 반응세기의 비율(%)	허용범위
> 50 %	≤ 20 %
> 20 %∼≤ 50 %	≤ 25 %
> 10 %∼≤ 20 %	≤ 30 %

나) 표준품 크로마토그램

그림 1. 콜리스틴(A : 4.65분, B : 4.47분, 0.15 mg/kg)

8) 정량시험

가) 정량

정성시험과 동일한 조건에서 얻어진 표준용액 크로마토그램상의 콜리스틴 A와 콜리스틴 B 각각의 피크 높이 또는 면적값을 합한 값으로 콜리스틴의 검량선을 작성하고, 시험용액의 크로마토그램으로부터 콜리스틴 A와콜리스틴 B 각각의 정량이온(Quantitative ion)의 피크 높이 또는 피크 면적값을 합한 값으로 콜리스틴을 정량한다.

나) 정량한계

(1) 유 : 0.01 mg/kg

(2) 유를 제외한 축·수산물 : 0.05 mg/kg