8.3.94 메틸벤조쿠에이트(Metylbenzoquate)에프로토마이신(Efrotomycin)

1) 시험법 적용범위

축산물 등에 적용한다.

2) 분석원리

검체 중 분석대상물질을 아세토니트릴로 추출하고 C18분말로 정제한 후 액체크로마토그래프/질량분석기로 분석한다.

3) 장치

액체크로마토그래프/질량분석기 (LC-MS/MS)

4) 시약 및 시액

가) 용매: 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것

나) 물: 3차 증류수 또는 이와 동등한 것

다) 표준원액: 100 mL 용량플라스크에 각 표준품을 정밀히 달아 0.1% 개미산함유메탄올 용액(메틸벤조쿠에이트는, 디메틸포름아미드(Dimethylformamide,DMF)으로 녹여 100 mg/L가 되게 한다. 조제된 표준원액은 냉동 보관한다.

라) 혼합표준용액: 100 mL 용량플라스크에 각 표준원액을 0.1% 개미산 함유 메탄올 용액으로 희석하여 적당한농도가되게 한다.

마) 0.1% 개미산(Formic acid) 함유 메탄올 용액: 1,000 mL 용량플라스크에 개미산 1 mL를 넣고 메탄올로 표시선까지 채운다.

바) 0.1% 개미산 용액: 1,000 mL 용량플라스크에 개미산 1 mL를 넣고 물로 표시선까지 채운다.

사) 기타시약: 특급 또는 이와 동등한 것

5) 시험용액의 조제

가) 유를 제외한 축산물

균질화된 검체 5 g을 50 mL 원심분리관에 취하고 황산마그네슘 4 g과아세토니트릴 15 mL를 가한다. 이를 15분간 진탕한 혼합한 후 2,000G에서10분간 원심분리하여 상층액을 취한다. 여기에 C18분말 500 mg을 넣고30초간 진탕한 후 2,000G에서 5분간 원심분리한 후 상층액 6 mL를 새로운 원심분리관에 취하여 50℃에서 질소농축한다. 0.1% 개미산 함유메탄올 용액 0.4 mL를 가하여 재분산 한 후 0.2 μm 막 여과지(PVDF membranefilter)로여과시킨 것을 시험용액으로 한다.

나) 유

균질화된 검체 5 g을 50 mL 원심분리관에 취하고 황산마그네슘 4 g,아세트산나트륨 1 g, 아세토니트릴 15 mL를 가한다. 이를 15분간 진탕혼합한 후 2,000G에서 10분간 원심분리하여 상층액을 취한다. 여기에C18분말 500 mg을 분산시킨 후 30초간 진탕한 후 2,000G에서 5분간원심분리한 후 상층액 6 mL를 새로운 원심분리관에 취하여 50℃에서 질소농축한다. 0.1% 개미산 함유 메탄올 용액 0.4 mL를 가하여 재분산한 후 0.2 μm 막 여과지(PVDF membrane filter)로여과시킨 것을 시험용액으로 한다.

6) 시험조작

가) 액체크로마토그래프 측정조건

(1) 칼럼C18(Kinetex 2.1 × 100 mm, 2.6 μm) 또는 이와 동등한 것

(2) 이동상

(가) 이동상 A: 0.1% 개미산 용액

(나) 이동상 B: 0.1% 개미산 함유 메탄올 용액

시간(분)	이동상 A(%)	이동상 B(%)
0	55	45
12	5	95
17	5	95
17.1	55	45
20	55	45

(3) 유속: 0.3 mL/분

(4) 칼럼온도: 45℃

(5) 주입량: 10 μL

나) 질량분석기 조건

(1) Ionization: ESI(Positive)

(2) Capillary Temperature: 250℃

(3) Collision gas: Ar (아르곤)

(4)분석대상물질의 개별 조건

연번	물질명 (Compound)	머무름 시간(분)	분자량 (MW)	선구이온 (Precursor ion, m/z)	생성이온 (Product ion, m/z)	충돌에너지 (CollisionEnergy, eV)
1	메틸벤조쿠에이트 (Methylbenzoquate)	7.8	365.4	366.0	228.0	41
					159.0	47
					215.0	34
2	에프로토마이신 (Efrotomycin)	7.7	1145.3	1145.6	1127.5	13
					775.3	20
					151.9	55

※밑줄 표시 되어 있는 것은 정량이온이며 그 외 이온들은 정성이온임

※각 생성이온 (production)에 대한 질량분석기의 기기조건은 사용기기의최적값으로 변경하여 사용할 수 있으며, 제시된 이외의 생성이온도 적용이 가능함

7) 정성시험

가)위의 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크는 표준용액 피크의 머무름 시간과비교하여 일치하여야 한다. 또한 표준용액과 시험용액의 선구이온(Precursor ion) 및 생성이온 (Product ion)이 일치하여야 하고, 표준용액과시험용액의 생성이온간 반응세기의 비율 (Response ratio)을 비교하여 그 비율이 주1)과 일치하여야 한다.

주1. 생성이온간 반응세기의 비율 허용범위

이온간 반응세기의 비율(%)	허용범위
> 50 %	≤20 %
> 20 % ∼ ≤ 50 %	≤25 %
> 10 % ∼ ≤ 20 %	≤30 %

나) 표준품 크로마토그램

그림 1. 메틸벤조쿠에이트, 에프로토마이신 표준품의 크로마토그램(각 0.01 mg/L)

8) 정량시험

가) 정량

정성시험과 똑같은 조건에서 표준용액을 일정농도로 제조한 후 얻어진 크로마토그램상의 각 피크 높이 또는 면적을 구하여 검량선을 작성하고, 시험용액의 크로마토그램으로부터 정량이온(Quantitative ion)의 각 피크 높이 또는 피크 면적에 따라 각각 정량한다.

나) 정량한계

메틸벤조쿠에이트 (Methylbenzoquate): 0.005 mg/kg

에프로토마이신 (Efrotomycin): 0.005 mg/kg