6.3.2.3.2 리놀레산

가. 시험법 적용범위

크릴유에 적용한다.

나. 분석원리

유지를 메탄올성 수산화나트륨용액으로 처리하여 알칼리염을 만든 후 트리플루오로보란메탄올 용액을 가하고 가열하여 에스테르화 한다. 생성된 지방산에스테르를 이소옥탄(isooctane)에 녹여 분석을 행한 후 크로마토그램의 지방산 피크의 총 면적 중 리놀레산(linoleic acid, C18:2) 피크의 면적 비율을 구하여 결과를 산출한다.

다. 장치

1) 기체크로마토그래프 : 불꽃이온화검출기(Flame Ionization Detector, FID)

2) 교반기(vortex mixer)

3) 가열기(heating block)

4) 질소농축기

라. 시약 및 시액

1) 14% 트리플루오로보란메탄올 용액(125 g BF3/L MeOH)

2) 메탄올성 수산화나트륨용액(0.5 N) : 수산화나트륨 2 g을 메탄올 100 mL로 조제한다. 장시간 방치하는 경우 흰 침전(탄산나트륨)이 생길 수 있으나 이는 무시하여도 된다.

3) 이소옥탄

4) 무수황산나트륨

5) 포화 염화나트륨용액

6) 내부표준용액 : 내부표준용액의 농도는 지방산 표준용액의 감응도(피크의 면적 또는 높이)보다 높게 조절한다.

(가) 지방산 사용시 : Triundecanoin(C11:0)을 이소옥탄에 녹여 사용한다.

(나) 지방산 메틸 에스테르 사용시 : Undecanoic acid methyl ester를 이소옥탄에 녹여 사용한다.

7) 표준용액의 조제

(가) 지방산 사용 시 : 분석하고자 하는 지방산 0.01 g을 이소옥탄 10 mL에 녹여 표준원액으로 한다(1 mg/mL). 지방산 표준원액을 적절한 농도로 희석한 표준용액 1 mL를 유리 튜브에 취하고 내부표준용액 1 mL를 첨가한다. (단, 표준용액과 시험용액의 내부표준물질 농도가 동일한 농도가 되도록 조절한다.) ★이어 0.5 N 메탄올성 수산화나트륨용액 1.5 mL를 가하고 질소를 불어넣은 후 즉시 뚜껑을 덮고 혼합한다. 이어 100℃ heating block에서 약 5분간 가온한다. 이를 냉각한 후 14% 트리플루오로보란메탄올 용액 2 mL를 가하고 다시 질소를 불어넣은 후 즉시 뚜껑을 덮고 혼합하고 100℃에서 30분간 가온한다. 이어 30～40℃로 냉각하여 이소옥탄 1 mL를 가하여 질소를 불어넣은 후 뚜껑을 덮고 이 온도에서 30초간 격렬히 진탕한다. 다음 즉시 포화 염화나트륨용액 5 mL를 가하고 질소를 불어넣은 후 뚜껑을 덮고 진탕한다. 상온으로 냉각한 후 수층으로부터 분리된 이소옥탄층을 무수황산 나트륨으로 탈수하여 표준용액으로 한다.

(나) 개별 지방산 메틸 에스테르 사용 시 : 분석하고자 하는 지방산 메틸 에스테르를 이소옥탄에 녹여 표준원액으로 한다(1 mg/mL). 표준원액을 적절한 농도로 희석한 용액 1 mL에 바) 내부표준용액 (2) 1 mL를 첨가하여 표준용액으로 한다.

마. 시험용액의 조제

검체 약 25 mg을 유리 튜브에 정밀히 취하고 내부표준용액 1 mL를 첨가한다. 7) 표준용액 (가)의 ★ 이하에 따라 시험하여 시험용액으로 한다.

바. 기체크로마토그래프 조건

1) 칼럼 : SP-2560 (100 m ⨉ 0.25 mm ⨉ 0.2 μm) 또는 이와 동등한 것

2) 주입부온도 : 225℃

3) 칼럼온도 : 100℃에서 4분간 유지한 후 3℃/min의 비율로 240℃까지 온도를 상승시키고 이후 15분 이상 유지한다.

4) 검출기온도 : 285℃

5) 유량 : 헬륨 0.75 mL/min

6) split ratio : 200 : 1

사. 지방산 분석

리놀레산 표준용액 1～2 μL를 주입한 후 RRT (Relative Retention Time; 내부표준물질에 대한 각 지방산들의 머무름 시간의 비)를 사용하여 리놀레산 피크의 위치를 확인한다. 이어 시험용액 1～2 μL를 주입하여 후 얻어진 크로마토그램에서 확인되는 모든 지방산 피크의 면적을 합한 총 피크 면적과 내부표준물질, 리놀레산 피크의 면적을 각각 구한 후 다음의 식에 따라 총 지방산 중 리놀레산의 비율을 구한다.

% 지방산	=	Ax× 100
		Atotal-Ai

Atotal : 크로마토그램에서 확인 된 모든 지방산 피크 면적의 합

Ai : 크로마토그램 중 내부표준물질 피크의 면적

Ax : 크로마토그램 중 리놀레산 피크의 면적