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▶ 제 8. 일반시험법 ▶ 2. 식품성분시험법 ▶ 2.2 미량영양성분시험법 ▶ 2.2.2 비타민류 ▶ 2.2.2.3 비타민B2
  • 2.2.2.3 비타민B2

    가. 루미플라빈 형광법

    1) 분석원리

    리보플라빈을 알칼리조건에서 광분해하여 루미플라빈으로 전환시킨 다음 이를 산성 조건에서 클로로포름에 이행시켜 황색의 형광광도를 측정하는 방법이다.

    2) 장치

    가) 광분해장치:형광등에 반사경을 달아 시험용액을 양측으로부터 조사하든지 또는 상부에 형광등이 붙어 있는 측면에는 광을 난반사하도록 한 상자모양의 것도 좋다.

    나) 용기:갈색 유리기구를 쓴다.

    다) 형광분광광도계:여기파장 430 nm, 측정파장 530 nm

    3) 시약 및 시액

    가) 클로로포름:형광이 없는 것 형광이 있는 것은 유리제의 증류장치를 써서 재증류한다. 갈색유리병에 넣어 물을 포화시켜 냉암소에 보존한다.

    나) 비타민B2표준용액:비타민B2표준품을 온탕에 녹여서 40 μg/mL로 한다. 그 100 mL에 초산 수 방울을 가해서 갈색 공전병에 넣어 냉장고에 보존한다. 사용 시 희석해서 2 μg/mL의 액을 만든다. 밝은 곳에 내놓지 않도록 주의한다.

    4) 시험용액의 조제

    검체의 일정량을 취해 소량의 물을 가해서 균질기 또는 막자사발에 넣어 마쇄한다. 지방이 많은 것은 미리 탈지한다. 이것에 물 수 mL~수십 mL를 가해 수욕 중에서 혼합 15~20분간 추출한다. 대부분의 것은 이 추출법으로 충분히 추출된다. 또는 비타민B14) 시험용액의 조제 나) 효소분해까지의 시험용액을 그대로 사용할 수 있다. 추출액은 냉각 후 1 mL중 0.05 μg이 되도록 일정 용량으로 하여 시험용액으로 한다.

    5) 시험방법

    가) 광분해

    시험용액 일정량(0.2~1 μg비타민B2를 함유하는 용액)씩을 3개의 공전시험관에 취한다. 그 한 개를 첨가시험용으로 해서 비타민B2의 일정량(0.2~1 μg)을 함유하는 용액을 가한다. 다른 두개 T2및 T3는 T1에 가한 비타민B2용액과 동량의 물을 가해서 T1, T2, T3를 같은 용량으로 한다. 이 검체용액에 1 N 수산화나트륨액을 동량 가해 혼합한 후 T1(첨가시험) 및 T2(주시험)를 광분해 장치로써 1시간 광분해 한다. T3(공시험)는 1시간 암소에 둔다. 광분해가 끝나면 각 시험관에 초산을 0.5 mL씩 가한다.

    나) 산화 및 추출

    광분해를 끝낸 산성용액에 4% 과망간산칼륨용액 0.5 mL를 가해서 1분간 방치한다(필요하면 초산을 소량 가한다). 계속해서 3% 과산화수소용액을 적가해서 탈색하고 클로로포름 10 mL씩을 가해서 뚜껑을 닫고 격렬히 2분간 진탕 혼합한다. 필요하면 원심분리를 행하고, 클로로포름층을 분취한다.

    6)측정 및 계산

    클로로포름층을 측정셀에 옮기고 T1(첨가시험), T2(주시험), T3(공시험)의 형광광도를 읽어 T1, T2, T3로 한다. 검체중의 비타민B2의 함량을 다음 식에 따라 구한다.

    비타민B2(mg/100 g) =

    D ×

    T2-T3

    ×

    V2

    ×

    100

    ×

    1

    T1-T2

    V1

    검체의 채취량(g)

    1,000

    D :첨가 비타민B2(μg)

    V1:시험용액 채취량(mL)

    V2:시험용액 전량(mL)

    나. 액체크로마토그래프에 의한 정량법

    1) 장치

    액체크로마토그래프 : 형광검출기를 사용한다.

    2) 시약 및 시액

    가) 메탄올:액체크로마토그래프용

    나) 10 mM NaH2PO4용액:1 N 수산화나트륨용액으로 pH 5.5로 조정한다.

    다) 표준용액의 조제

    (1) 리보플라빈 표준용액:2.2.2.3 비타민B
    2가. 루미플라빈 형광법과 동일하게 조제하고 사용 시 물로 희석하여 0.2 ㎍/mL의 용액으로 만든다.

    (2) FMN(Flavin mononucleotide) 표준용액:FMN을 물에 녹여 0.2 ㎍/mL(리보플라빈으로 환산: × 0.7868* 또는 × 0.7317 **)의 용액으로 만든다.

    * 376.36(리보플라빈 분자량)/478.33(FMN 무수물 분자량)

    ** 376.36(리보플라빈 분자량)/514.36(FMN 이수화물 분자량)

    (3) FAD(Flavin adeninedinucleotide) 표준용액:FAD를 물에 0.5 ㎍/mL(리보플라빈으로 환산: × 0.4537*)의 용액으로 만든다.

    * 376.36(리보플라빈 분자량)/829.51(FAD 무수물 분자량)

    3) 시험용액의 조제

    검체 일정량을 달아 소량의 물을 가해 균질기 또는 막자사발에서 가능한 한 미세하게 분쇄하고 지방이 많은 경우에는 미리 탈지한다. 이에 물을 가해 수욕중(70~80℃)에서 잘 혼합하여 12~20분간 추출한다. 추출액은 식힌 후 1 mL 중 비타민B20.05~0.5 μg이 되도록 일정용량으로 하여 시험용액으로 한다.

    4) 시험방법

    가) 액체크로마토그래프 조건

    (1) 칼럼:역상 분배형(μ-Bondapak C
    18, Micropak-CH, Cosmosil 5 C 18, Develesil ODS 등)

    (2) 이동상:메탄올:10 mM NaH
    2PO4용액(pH 5.5) (35:65)

    (3) 유속:0.8 mL/분

    (4) 검출기:형광검출기(여기파장:445 nm, 측정파장:530 nm)

    5) 측정 및 계산

    시험용액 및 각 형의 표준용액을 각 10 μL씩 주입하여 앞의 조건에서 시험한다. 표준용액 각 형의 피크 면적 또는 높이에 의해 구한 검량선을 사용하여 시험용액의 비타민B2의 농도(μg/mL)를 구하고, 다음 식에 의해 검체중 비타민B2함량(mg/100 g)을 산출한다.

    비타민B2(리보플라빈, FMN, FAD)(mg/100 g)=S ×

    a×b

    ×

    100

    검체채취량(g)

    1,000

    S:시험용액중의 비타민B2의 농도(μg/mL)

    a:시험용액의 전량(mL)

    b:시험용액의 희석배수