4.22 탄저균(Bacillus anthracis)

가. 배양 및 균분리

검체 25 g 또는 25 mL에 희석액 50 mL을 가하여 분쇄 혼합한 뒤, 62.5±0.5℃ 항온수조에서 30～60분간 가열처리한다. 배양된 유제를 10배 단계 희석하여 각 희석액으로부터 100 μL를 취하여 혈액한천배지(배지 79)에 도말하여 37℃에서24시간 배양한다. 검체를 가하지 아니한 동일 희석액을 대조시험액으로 하여 시험조작의 무균여부를 확인한다.탄저균은 그 균의 특이한 회백색의 축모상 혹은 곰보유리모양의 집락을 형성하며 혈액한천배지에서는 용혈성이 거의 없고 액체배지에서는 침전하여 발육하며 상층부는 투명하고 균막을 형성하지 않는다. 의심되는 집락을 도말하여 염색하면 그람양성의 대간균으로서 양단이 직각으로 갈라져 있고 낚시대 모양의 연쇄상을 나타낸다.

나. 동물시험

다른 방법으로도 탄저균을 분리해내지 못 하는 경우, 동물접종시험을 고려할 수 있다. 62.5℃에서 15분간 가열한 후 다 자란 마우스의 피하에 0.05～0.1 mL 접종한다. Guinea pig의 양쪽 하퇴부 근육에 0.2 mL씩 총 0.4 mL 접종한다. 양성인 경우 48～72시간 내에 폐사한다. 이를 해부하여 병리학적 소견을 관찰하고 도말하여 협막염색을 실시하여 협막형성균을 검경으로 확인한 후 다시 균을 분리 동정한다. 폐사된 동물의 혈액으로부터 균을 분리배양 할 수 있다.

다. PCR 반응을 통한 병원성 시험

Target	프라이머	Sequence 5'-3'	크기	농도
Protective antigen(PA)	PA 5 3048-3029	TCC-TAA-CAC-TAA-CGA-AGT-CG	596 bp	1 mM
	PA 8 2452-2471	GAG-GTA-GAA-GGA-TAT-ACG-GT
Capsule	1234 1411-1430	CTG-AGC-CAT-TAA-TCG-ATA-TG	846 bp	0.2 mM
	1301 2257-2238	TCC-CAC-TTA-CGT-AAT-CTG-AG

보통한천배지(배지 8)에서 배양한 탄저균 1 백금이를 25 μL의 증류수에 희석하여 95℃에서 20분간 가열한 다음, 4℃로 식혀 원심분리하여 상층액을 PCR반응의 template로 사용한다. pX01과 pX02 plasmid의 존재를 확인할 수 있는 primer는 아래와 같다.

PCR은 총 50 μL로 실행하되, dATP, dCTP, dTTP, dGTP 각각 200 μM씩, MgCl2 1.5 mM, Taq DNA polymerase 2.5 unit, NH4 buffer를 넣고 template DNA를 5 μL 첨가한다. 전기영동은 2% agarose gel에서 가장 잘 확인할 수 있다. PCR 반응조건은 아래와 같다.

구분	온도	시간	반응회수
초기변성	95℃	5분	-
변성	95℃	0.5분	30 회
결합	55℃	0.5분
신장	72℃	0.5분
최종신장	72℃	5분	-

※ 상기 PCR 조건이 최적이 아닌 경우 변형하여 사용할 수 있다.