7.1.2.8 클레토딤(Clethodim), 프로폭시딤(Profoxydim)

가. 시험법 적용범위곡류, 서류, 두류, 과일류, 채소류 등 식품에 적용한다.

나. 분석원리시료 중 대상성분을 메탄올 : 물(1 : 1) 혼합액을 넣어 모화합물 및 산화대사산물을 동시에추출하고 클로로과산화벤조익산(m-CPB)으로 산화반응시킨다. 전환된 설폰(sulfone)를액-액 분배하여 플로리실 컬럼크로마토그래피로 정제한 후 액체크로마토그래프로 분석한다.

다. 장치

1) 액체크로마토그래프-자외선흡광검출기(HPLC-UVD)

2) 액체크로마토그래프-질량분석기(LC-MS)

라. 시약 및 시액

1) 용매 : 잔류농약 시험용 또는 특급

2) 물 : 3차 증류수 또는 이와 동등한 것

3) 표준원액 : 클레토딤 표준품을 아세토니트릴에 녹여 200 mg/L가 되게 한다. 프로폭시딤 및 리튬염 표준품을 각각 메탄올에 녹여 200 mg/L가 되게 한다.

4) 표준용액 : 표준원액을 아세토니트릴에 녹여 적절한 농도로 혼합, 희석한다.

5) 클로로과산화벤조익산(m-chloroperoxybenzoic acid, m-CPB) 용액 : 디클로로메탄에 1%가 되도록 녹이며 사용 직전 조제한다.

6) 티오황산나트륨(sodium thiosulfate) 용액 : 10% 수용액을 조제한다.

7) 플로리실(Florisil) : 컬럼크로마토그래피용 플로리실(60～100 mesh)을 130℃에서 하룻밤 가열한 후 데시케이터에서 보관하여 사용한다.

8) 기타시약 : 잔류농약 시험용 또는 특급

마. 시험용액의 조제

1) 추출
시료 10 g을 정밀히 달아 추출 용기에 넣고 메탄올 : 물(1 : 1) 혼합액 100 mL를 가한 후 2분간 강하게 흔들어 추출한다. 곡류 등 건조 시료의 경우 추출 전에 미리 30분간 방치, 습윤화한다. 추출물을 여과지가 깔려 있는 부흐너깔때기로 흡인 여과하고 메탄올 : 물(1 : 1) 혼합액 50 mL로 잔류물 및 용기를 씻어 내려 앞의 여과액과 합한다. 합한 여과액을 500 mL 용량의 분액깔때기에 옮기고 포화염화나트륨용액 50 mL, 물 50 mL, 초산 0.5 mL 및 디클로로메탄 50 mL를 차례로 가한 후 1분 이상 흔들어 섞는다. 정치하여 층을 분리시킨 후 하층인 디클로로메탄층을 20 g의 무수황산나트륨층에 통과, 탈수하여 250 mL 용량의 감압농축플라스크에 받는다. 수용액 층에 재차 디클로로메탄 50 mL를 가한 후 위의 분배 추출과정을 반복한다. 합친 디클로로메탄 추출액을 40℃에서 감압 농축, 건고한 후 디클로로메탄 25 mL에 녹인다.

2) 산화반응
위 용액에 1% m-CPB 용액 5 mL를 가한 후 가볍게 흔들어 섞고 30℃에서 2분간 정치하여 층을 분리시켜 반응시킨다. 반응 후 10% 티오황산나트륨 수용액 30 mL를 가한 후 3분간 흔들어 섞어 반응을 종결시킨다. 반응액을 250 mL 용량의 분액깔때기에 옮기고 잔류물을 재차 디클로로메탄 10 mL로 씻어 옮긴다. 분액깔때기에 10%의 염화나트륨 수용액 80 mL와 0.1 N 황산수용액 2 mL를 넣고 흔들어 섞은 후 정치하여 층을 분리시켜 하층인 디클로로메탄층을 20 g의 무수황산나트륨층에 통과, 탈수하여 125 mL 용량의 감압농축플라스크에 받는다. 수용액 층에 재차 디클로로메탄 30 mL를 가한 후 위의 분배 추출과정을 반복한다. 합한 디클로로메탄 추출액을 40℃에서 감압 농축, 건고한 후 잔류물을 디클로로메탄 10 mL에 녹인다.

3) 정제
안지름 11 mm, 길이 400 mm의 유리컬럼에 플로리실 5 g과 무수황산나트륨을 약 2 cm 높이로 차례로 충전한 후 디클로로메탄 25 mL를 넣어 유출시켜 버린다. 고정상 상단이 노출되기 전에, ‘2) 산화반응’으로부터 얻은 디클로로메탄 10 mL를 넣어 유출시켜버리고, 디클로로메탄 5 mL로 용기 및 컬럼 벽면을 씻어 유출시켜 버린다. 고정상 상단이 노출되기 전에 아세톤 : 디클로로메탄(10 : 90) 혼합액 40 mL를 유출시켜 버리고 재차 60 mL의 메탄올 : 아세톤(1 : 99) 혼합액으로 용출하여 받는다. 이를 40℃에서 감압 농축, 건고한 후 2 mL의 아세토니트릴에 녹여 기기분석 전에 0.2% 초산 수용액과 1 : 1로 혼합하여 시험용액으로 한다.

바. 시험조작

1) 액체크로마토그래프의 분석조건

가) 컬럼 : C18(4.0 mm × 250 mm, 5 μm) 또는 이와 동등한 것

나) 이동상 : 아세토니트릴과 0.1% 초산의 혼합비를 35 : 65로 1분간 유지 후 75 : 25로 30분간 직선적으로 농도 구배한다.

다) 이동상 유속 : 1 mL/분

라) 컬럼 온도 : 40℃

마) 검출파장 : 256 nm

바) 주입량 : 20 μL

2) 검량선의 작성
농도별로 아세토니트릴에 조제한 표준혼합용액 일정량을 반응 플라스크에 취하고 질소가스를 사용하여 증발 건고한 직후 위의 m-CPB 산화반응과정을 동일하게 수행한다. 디 클로로메탄 추출액을 감압 농축, 건고한 후 아세토니트릴 2 mL에 녹여 0.2% 초산 수용액과 1 : 1로 혼합하여 액체크로마토그래프에 각각 주입한다. 얻어진 크로마토그램 상에서 각 대상성분 설폰의 피크 면적 또는 높이를 기준으로 모화합물로 환산하여, 검량선을 작성한다.

3) 표준품의 크로마토그램

그림 1. 액체크로마토그래프에서 표준품의 크로마토그램 예시.

가. 산화반응 공시험액, 나. 표준품 첨가 후 산화반응 시험액

1 : 클레토딤 설폰(11.9분), 2 : 프로폭시딤 설폰(19.7분)

4) 정량한계
0.04 mg/kg

사. 정량시험위 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크가 표준용액 피크의 머무름 시간과 일치할 때 피크 높이 또는 면적을 검량선에 대입하여 정량한다.

아. 확인시험액체크로마토그래프-질량분석기상의 머무름 시간과 질량분석 스펙트럼으로 클레토딤 및 프로폭시딤을 확인한다.

1) 액체크로마토그래프-질량분석기의 분석조건

가) 컬럼 : C18(2.1 mm × 150 mm, 3 μm) 또는 이와 동등한 것

나) 이동상 : 아세토니트릴과 0.1% 초산의 혼합비를 35 : 65로 1분간 유지 후 75 : 25로 30분간 직선적으로 농도 구배한다.

다) 이동상 유속 : 0.2 mL/분

라) 컬럼 온도 : 40℃

마) 주입량 : 10 μL

바) 이온화 : ESI positive ion mode

사) 분자량 범위 : 100～500m/z

아) 액체크로마토그래프-질량분석기 분석을 위한 특성이온

분석성분 (Compound)	머무름 시간 (분)	분자량 (MW)	이온 (m/z)
클레토딤 설폰 (Clethodim sulfone)	16.1	391.9	392
프로폭시딤 설폰 (Profoxydim sulfone)	r 26.5	498.0	498