8.3.4 네오마이신(Neomycin)

1) 시험법 적용범위

벌꿀에 적용한다.

2) 분석원리

벌꿀에 물을 넣어 균질화한 후 SPE(Solid Phase Extraction) 칼럼으로 정제하여 액체크로마토그래프/질량분석기로 분석한다.

3) 장치

액체크로마토그래프/질량분석기(LC-MS/MS)

4) 시약 및 시액

가) 용매：액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것

나) 물：3차 증류수 또는 이와 동등한 것

다) 표준원액：네오마이신 표준품을 정밀히 달아 메탄올에 녹여 100 μg/mL로 하고 영하 20℃에 보관한다.

라) 표준용액：표준원액을 메탄올에 적당한 농도로 희석하여 사용한다.

마) MCX(Mixed Mode Cation Exchange)카트리지 또는 이와 동등한 것

바) 기타시약：특급

5) 시험용액의 조제

균질화한 검체 5 g에 물 20 mL를 넣고 진탕하여 충분히 녹이고 0.1 M 염산을사용하여 pH 2로 조정한다. 이 액을 미리 메탄올 5 mL와 물 5 mL로 활성화시킨 MCX 카트리지(충진제 60 mg)에 흡착시키고 5 mL의 10% 메탄올성 수산화암모늄용액으로 용출한다. 용출액은 45℃ 이하의 수욕중에서 감압하여 농축하고 잔류물은 0.1 M 염산 1 mL로 녹인 후 막 여과지(membrane filter)로 여과하여 시험용액으로 한다.

6) 시험조작

가) 측정조건

(1) 액체크로마토그래프 조건

(가) 칼럼：C18(2.1×100 mm, 3.5 μm) 또는 이와 동등한 것

(나) 이동상

①이동상 A：20 mM 개미산, 10 mM 노나플루오로펜탄산(nonafluoropentanoicacid) 수용액

②이동상 B：20 mM 개미산, 10 mM 노나플루오로펜탄산(nonafluoropentanoicacid) 메탄올용액

시간(분)	A(%)	B(%)
0.0	50	50
0.5	30	70
5.0	5	95
5.1	50	50
10.0	50	50

(다) 유속：0.2 mL/분

(라) 주입량：10 μL

(2) 질량분석기 조건

(가) Ionization：ESI(positive)

(나) Gas Temp.：350℃

(다) Gas Flow：8 L/분 (질소)

(라) Nebulizer：35 psi

(마) Collision energy：30 V

7) 정량시험

시험용액 및 표준용액을 각각 질량분석기에 주입하여 아래표의 특이이온(specific ion)을 확인한다. 이후, 각각에서 얻은 크로마토그램으로부터 머무름 시간(retention time)을 비교하고m/z161의 피크에 대한 평균면적으로 검량선을 작성하여 검체 중 네오마이신의 함량을 구한다. 검량선 작성은 표준용액 2.5, 5.0, 10, 25, 50 μg/L의 5개 농도를 이용한다.

물질	선구이온 (Precursor Ion, m/z)	생성이온 (Product ion, m/z)
네오마이신	615	455, 323, 163, 161