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▶ 제 8. 일반시험법 ▶ 8. 식품 중 잔류동물용의약품시험법 ▶ 8.3 정량시험법 ▶ 8.3.12 노르제스토메트(Norgestomet), 디에네스트롤(Dienestrol), 디에틸스틸베스트롤(Diethylstilbestrol), 알트레노제스트(Altrenogest), 에스트라디올(Estradiol-17β), 제라놀(Zeranol), 초산메드록시프로게스테
  • 8.3.12 노르제스토메트(Norgestomet), 디에네스트롤(Dienestrol), 디에틸스틸베스트롤(Diethylstilbestrol), 알트레노제스트(Altrenogest), 에스트라디올(Estradiol-17β), 제라놀(Zeranol), 초산메드록시프로게스테론(Medroxyprogesterone acetate), 초산멜렌게스트롤(Melengestrol acetate), 초산트렌볼론(Trenbolone acetate), 테스토스테론(Testosterone), 프로게스테론(Progesterone), 헥스트롤(Hexestrol)
    1) 시험법 적용범위
    축·수산물 등에 적용한다. 단, 프로게스테론(Progesterone)의 경우 유 및 알은 제외한다.
    2) 분석원리
    검체 중 분석대상물질을 아세트산 함유 아세토니트릴/메탄올 혼합용액(1:1, v/v)으로 추출하고 헥산 또는 일차이차아민(Primary secondary amine, PSA)로 정제한 후 액체크로마토그래프/질량분석기로 분석한다.
    3) 장치
    액체크로마토그래프/질량분석기(LC-MS/MS)
    4) 시약 및 시액
    가) 용매액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것
    나) 물: 3차 증류수 또는 이와 동등한 것
    다) 표준원액: 각 동물용의약품 표준품을 100 mL 용량플라스크에 각각 정밀히 달아 메탄올에 녹여 100 mg/L가 되게 한다. 조제된 표준원액은 냉동 보관한다.
    라) 혼합표준용액: 100 mL 용량플라스크에 각 표준원액을 잔류허용기준의 10배 농도가 되도록 취하여 혼합한 후 메탄올로 표시선까지 채워 조제한다. 혼합표준용액은 메탄올로 희석하여 사용한다.
    마) 10 mM 아세테이트 완충용액(pH 4.6): 1,000 mL 용량플라스크에 아세트산나트륨(Sodium acetate) 0.82 g을 넣고 물로 표시선까지 채운다. 아세트산으로 pH 4.6이 되도록 조정하여 사용한다.
    바) 1% 아세트산(Acetic acid) 함유 아세토니트릴/메탄올 혼합용액(1:1, v/v): 100 mL 용량플라스크에 아세트산 1 mL을 넣고 아세토니트릴/메탄올(1:1, v/v) 혼합용액으로 표시선까지 채운다.
    사) 0.1 mM 불화암모늄(Ammonium fluoride) 용액: 1,000 mL 용량플라스크 불화암모늄 3.7 mg을 넣고 물로 표시선까지 채운다.
    아) 기타시약: 특급 또는 이와 동등한 것
    5) 시험용액의 조제
    균질화한 검체 2 g을 50 mL 원심분리관에 취하여 10 mM 아세테이트 완충용액(pH 4.6) 2 mL을 넣고 2분간 초음파 처리하여 균질화한다. β-글루쿠로니다제/아릴설파타제(β-Glucuronidase/Arylsulfatase) 20 μL를 첨가하고 65℃에서 1시간 중탕한 후 상온에서 냉각한다. 이 용액에 1% 아세트산 함유 아세토니트릴/메탄올(1:1, v/v) 혼합용액을 12 mL 가하여 10분간 초음파 처리 후 15분간 진탕하고 –4℃에서 9,300 G로 10분간 원심분리한다. (㉠돼지고기를 제외한 축수산물의 경우, 새로운 50 mL 원심분리관에 상층액을 취하여 헥산 12 mL을 넣고 2분간 진탕한다. -4℃에서 9,300 G로 5분간 원심분리한 후 하층액을 취하여 감압농축한다. ㉡돼지고기의 경우, PSA 500 mg이 담겨진 50 mL 원심분리관에 상층액을 취하여 5분간 진탕한다. -4℃에서 9,300 G로 5분간 원심분리한 후 상층액을 취하여 감압농축한다.) 잔류물에 50% 메탄올 1 mL을 넣어 녹이고 상온에서 15,800 G로 10분간 원심분리한 후 상층액을 시험용액으로 한다.
    6) 시험조작
    가) 액체크로마토그래프 측정조건
    (1) 칼럼: C18(Shim-pack, 2.1 mm × 100 mm, 2.0 μm) 또는 이와 동등한 것
    (2) 이동상
    (가) 이동상 A: 0.1 mM 불화암모늄 용액
    (나) 이동상 B: 메탄올

    시간(분) 이동상 A(%) 이동상 B(%)
    0.0 50 50
    4.0 0 100
    7.0 0 100
    7.01 50 50
    10.0 50 50
    (3) 유속: 0.3 mL/분
    (4) 칼럼온도: 40℃
    (5) 주입량: 5 μL
    나) 질량분석기 조건
    (1) Ionization: ESI(Positive, Negative)
    (2) Capillary temperature: 300℃
    (3) Collision gas: N2 (질소)
    (4) 분석대상물질의 개별 조건
    연번 물질명
    (Compound)
    이온화 (Ionization mode) 머무름 시간(분) 분자량
    (MW)
    선구이온
    (Precursor ion, m/z)
    생성이온
    (Product ion, m/z)
    충돌에너지
    (Collision energy,eV)
    1 노르제스토메트
    (Norgestomet)
    Positive 3.91 372.5 373.0 313.3 -13.0
    271.2 -17.0
    109.2 -33.0
    2 디에네스트롤
    (Dienestrol)
    Negative 3.69 266.3 264.9 92.8 26.0
    248.9 27.0
    220.9 26.0
    3 디에틸스틸베스트롤
    (Diethylstilbestrol)
    Negative 3.67 268.4 266.9 236.9 29.0
    250.9 25.0
    221.9 35.0
    4 알트레노제스트
    (Altrenogest)
    Positive 4.05 310.4 311.0 227.1 -24.0
    269.1 -15.0
    293.3 -18.0
    5 에스트라디올
    (Estradiol-17β)
    Negative 3.67 272.4 271.0 144.9 41.0
    182.9 41.0
    143.1 54.0
    6 제라놀
    (Zeranol)
    Negative 3.57 322.4 320.9 277.1 23.0
    303.0 22.0
    258.9 26.0
    7 초산메드록시프로게스테론
    (Medroxyprogesterone acetate)
    Positive 4.19 386.5 387.0 327.4 -16.0
    123.1 -29.0
    8 초산멜렌게스트롤
    (Melengestrol acetate)
    Positive 4.26 396.5 397.1 279.3 -21.0
    337.4 -16.0
    221.3 -41.0
    9 β-트렌볼론
    (β-Trenbolone)
    Positive 3.38 270.4 271.0 199.2 -22.0
    253.3 -21.0
    165.1 -52.0
    10 테스토스테론
    (Testosterone)
    Positive 3.73 288.4 289.0 97.1 -25.0
    109.2 -27.0
    79 -49.0
    11 프로게스테론
    (Progesterone)
    Positive 4.28 314.5 315.0 96.9 -26.0
    109.2 -23.0
    297.3 -16.0
    12 헥스트롤
    (Hexestrol)
    Negative 3.759 270.4 268.9 118.8 38.0
    133.9 16.0
    132.9 16.0
    ※ 밑줄 표시 되어 있는 것은 정량이온이며 그 외 이온들은 정성이온임
    ※ 각 생성이온(Product ion)에 대한 질량분석기의 기기조건은 사용기기의 최적값으로 변경하여 사용할 수 있으며, 제시된 이외의 생성이온도 적용이 가능함
    7) 정성시험
    가) 정성
    위의 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크는 표준용액 피크의 머무름 시간과 비교하여 일치하여야 한다. 또한 표준용액과 시험용액의 선구이온(Precursor ion) 및 생성이온(Product ion)이 일치하여야 하고, 표준용액과 시험용액의 생성이온간 반응세기의 비율(Response ratio)을 비교하여 그 비율은 주1)과 일치하여야 한다.
    주1. 생성이온간 반응세기의 비율 허용범위

    이온간 반응세기의 비율(%) 허용범위
    > 50 % ≤ 20 %
    > 20 % ∼ ≤ 50 % ≤ 25 %
    > 10 % ∼ ≤ 20 % ≤ 30 %

    나) 표준품 크로마토그램

    그림 1. 노르제스토메트, 디에네스트롤, 디에틸스틸베스트롤, 알트레노제스트, 에스트라디올, 제라놀, β-트렌볼론, 테스토스테론, 프로게스테론, 헥스트롤 표준품의 크로마토그램(각 0.01 mg/L)
     
    8) 정량시험
    가) 정량
    정성시험과 똑같은 조건에서 음성검체에(Blank sample)에 혼합표준용액을 일정농도로 제조한 후 얻어진 크로마토그램상의 각 피크 높이 또는 면적을 구하여 검량선을 작성하고, 시험용액의 크로마토그램으로부터 정량이온(Quantitative ion)의 각 피크 높이 또는 피크 면적에 따라 각각 정량한다.
    나) 정량한계

    동물용의약품 정량한계(mg/kg)
    식육 우유 수산물
    노르제스토메트(Norgestomet) 0.002
    (소: 0.00003)
    0.00006 0.0008 0.003
    디에네스트롤(Dienestrol) 0.003 0.004 0.003 0.003
    디에틸스틸베스트롤
    (Diethylstilbestrol)
    0.0005 0.0004 0.0002 0.0004
    알트레노제스트(Altrenogest) 0.0002 0.0002 0.00004 0.0002
    에스트라디올(Estradiol-17β) 0.004 0.005 0.004 0.003
    제라놀(Zeranol) 0.001
    (소: 0.0005)
    0.004 0.001 0.001
    초산메드록시프로게스테론
    (Medroxyprogesterone acetate)
    0.002 0.003 0.0008 0.002
    초산멜렌게스트롤
    (melengestrol acetate)
    0.001
    (소: 0.0003)
    0.002 0.0005 0.003
    β-트렌볼론(β-Trenbolone) 0.004
    (소: 0.0002)
    0.004 0.003 0.002
    테스토스테론(Testosterone) 0.002 0.002 0.001 0.002
    프로게스테론(Progesterone) 0.004 - - 0.002
    헥스트롤(Hexestrol) 0.003 0.005 0.002 0.003