8.3.29 페닐부타존(Phenylbutazone)

8.3.29.1 제1법

1) 시험법 적용범위
축산물(가금류 제외) 등에 적용한다.

2) 분석원리
시료중 페닐부타존을 에틸아세테이트로 추출하고 실리카 카트리지로 정제하여 액체크로마토 그래프/질량분석기로 분석한다.

3) 장치
액체크로마토그래프/질량분석기(LC-MS/MS)

4) 시약 및 시액

가) 용매: 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것

나) 물: 3차 증류수 또는 이와 동등한 것

다) 표준원액: 표준품을 메탄올 80 mL와 25%D,L-디티오트레이톨(dithiothreitol) 5 mL에 녹인 후 메탄올로 표시선을 맞춰 100 mg/L로 조제한 액을 표준원액으로 한다.

라) 표준용액: 표준원액을잔류허용기준 또는 검출에 적합한 농도가 되도록0.2 N 초산:아세토니트릴(1:1, v/v) 혼합용액으로 희석하여 사용한다.

마) 25%D,L-디티오트레이톨:D,L-디티오트레이톨 125 mg을 에틸아세테이트 500 mL에 녹인다. 당일 제조하여 사용한다.

바) 실리카 카트리지: Silica 카트리지(500 mg, 6 mL) 또는 이와 동등한 것

사) 기타시약: 특급또는 이와 동등한 것

5) 시험용액의 조제
균질화한시료2 g을 50 mL 원심분리관에 취하여 메탄올:25% D,L-디티오쓰레이톨 (1:7, v/v) 혼합용액 15 mL를 넣은 후 10분간 흔들어 섞어 추출 한다.3,000 G에서 5분간 원심분리하여 상층액을 농축플라스크에 취한다. 잔류물에 메탄올:25% D,L-디티오트레이톨(1:7, v/v) 혼합용액 15 mL를 넣은후위의 과정을 한 번 더 반복한다. 모은 상 층액은50℃ 이하에서 감압(또는 질소)농축 하고잔류물은테트라하이드로퓨란(tetrahydrofuran) :헥산(1:4, v/v) 혼합용액 15 mL를 3번에 나누어 녹인다.이 용액을 미리 테트라하이드로퓨란 :헥산(1:4, v/v) 혼합용액 5 mL로 활성화시킨 실리카 카트리지에 넣어용출하여 받는다 . 이 용출액은50℃ 이하에서감압(또는 질소)농축하고 잔류물은0.2 N 초산:아세토니트릴(1:1, v/v) 혼합용액2 mL에 녹인 후멤브레인필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

6) 시험조작

가) 액체크로마토그래프 조건

(1) 컬럼: C18(1.5 mm × 150 mm, 5 μm) 또는 이와 동등한 것

(2) 이동상:10 mM 초산암모늄 함유 5% 초산 수용액:아세토니트릴(1:1, v/v) 혼합용액

(3) 유속: 0.2 mL/분

(4) 컬럼 온도: 40℃

(5) 주입량: 10 μL

나) 질량분석기 조건

(1) Ionizationmode: ESI(negative)

(2) Capillary temperature: 350℃

(3) Collision gas: Ar(아르곤)

(4) Collision energy: 21eV

(5) 분석대상물질의 조건

물질명 (Compound)	이온화 (Ionization mode)	관즉질량 (Exact mass)	선구이온 (Precursor ion,m/z)	생성이온 (Product ion,m/z)	충돌 에너지 (Collision energy, eV)
페닐부타존 (Phenylbutazone)	Negative	308.2	307	160 188 279	21

※ 밑줄 표시되어 있는 것은 정량이온이며 그 외 이온들은 정성이온임

7) 정성 및 확인

위의 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크는 표준용액 피크의 머무름 시간과 비교하여일치하여야 한다. 또한 표준용액과 시험용액의 선구이온(precursor ion) 및 생성이온(product ion)이 일치하여야 하고, 표준용액과 시험용액의 생성이온간 반응세기의 비율(ion ratio)을 비교하여 그 비율은 주1)과 일치하여야 한다. 확인시험의 경우, 음성시료
(blank sample)에 해당 물질을 넣은 것을 시료와 동일하게 전처리하여 얻은 표준용액 으로서 비교한다.

주1)생성이온간 반응세기의 비율 허용범위

이온간 반응세기의 비율 (Base peak에 대한 %)	허용범위
> 50%	± 20%
> 20%, ≤ 50%	± 25%
> 10%, ≤ 20%	± 30%

8) 정량시험

가) 정량

조직표준곡선(tissue standard curve) 작성을 위하여 각 해당 물질이 검출되지 않은 음성시료(blank sample) 2 g씩 준비한 후 음성시료(blank sample)를 포함하여 5개 이상의 농도로 전처리하여 표준용액을 제조한다. 각 농도별 첨가시료에서 얻어진 크로마토그램상의 각 피크 높이 또는 면적을 구하여 검량선을 작성한 후, 시험용액의 크로마토그램으로부터 정량이온(quantitative ion)의 각 피크 높이 또는 피크 면적에 따라 산출된 시험용액 중 검출농도,시료량과 최종 시험용액의 부피를 고려하여 정량한다.

나) 정량한계

페닐부타존(Phenylbutazone): 0.01 mg/kg

8.3.29.2 제2법

1) 시험법 적용범위

축산물(가금류) 등에 적용한다.

2) 분석원리

시료중의 페닐부타존을 아세트산(acetic acid), 염화나트륨(sodium chloride), 아세트산암모늄(ammonium acetate),아세토니트릴:디클로로메탄(85:15, v/v) 혼합용액으로 추출하고 PSA(Primary Secondary Amine), C18, 황산마그네슘(MgSO4)으로 정제하여 액체크로마토그래프/
질량분석기로 분석한다.

3) 측정기기

액체크로마토그래프/질량분석기(LC-MS/MS)

4) 시약 및 시액

가) 용매: 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것

나) 물: 3차 증류수 또는 이와 동등한 것

다) 표준원액: 표준품을 아세토니트릴에 녹여조제한 용액을 표준원액으로 한다. 조제된 표준원액은 냉동 보관한다.

라) 표준용액: 표준원액잔류허용기준 또는 검출에 적합한 농도가 되도록아세토니트릴로 희석하여 사용한다.

마) 2 mM 아세트산암모늄 수용액: 1,000 mL 용량플라스크에 아세트산암모늄 0.154 g을 넣고 물로 표시선까지 채운다.

바) 2 mM 아세트산암모늄 함유 아세토니트릴: 1,000 mL 용량플라스크에 아세트산암모늄0.154 g을 넣고 아세토니트릴로 표시선까지 채운다.

사) 100 mM 아세트산암모늄 용액: 1,000 mL 용량플라스크에 아세트산암모늄 7.708 g을 넣고물로 표시선까지 채운다.

아) 기타시약: 특급 또는 이와 동등한 것

5) 첨가시료의 조제

조직표준곡선(tissue standard curve) 작성을 위하여 각 해당 물질이 검출되지 않은 음성시료(blank sample) 2 g씩 준비한 후음성시료(blank sample)를 포함하여 5개 이상의 농도로 전처리하여 표준용액을 제조한다.

6) 시험용액의 조제

균질화한시료2 g을 정밀히 달아 50 mL 원심분리관에 취하고100 mM 아세트산암모늄 용액 1 mL,아세토니트릴:디클로로메탄(85:15, v/v) 혼합용액5 mL와 NaCl 1 g, 아세트산 0.05 mL를 넣고 10분간흔들어 섞는다. 2,700G, 4℃에서 10분간원심분리 후 상층액을 취하여 새로운 원심분리관에 옮긴다. MgSO437.5 mg, PSA 6.25 mg, C186.25 mg을넣은 뒤1분간흔들어 섞은 후,2,700G, 4℃에서 10분간 원심분리한다. 원심분리한 상층액 중 15 mL 튜브에 취하여 새로운 원심분리관에 옮기고40℃ 이하에서질소농축한다. 잔류물에 아세토니트릴 0.4 mL를 넣어녹이고1분간흔들어 섞은 후3분간 초음파분쇄한다. 13,500G, 4℃에서 3분간 원심분리한 후 상층액을 취하여 시험용액으로 한다.

7) 시험조작

가) 액체크로마토그래프 측정조건

(1) 컬럼: C18(2.1 mm ｘ 150 mm, 3.5 μm) 또는 이와 동등한 것

(2) 이동상

(가) 이동상 A: 2 mM 아세트산암모늄수용액

(나) 이동상 B: 2 mM 아세트산암모늄 함유 아세토니트릴

시간(분)	이동상 A(%)	이동상 B(%)
0.00	100	0
0.20	100	0
5.50	45	55
6.00	0	100
8.50	0	100
8.51	100	0
13.00	100	0

(3) 유속: 0.25 mL/분

(4)컬럼온도: 40℃

(5) 주입량: 2 μL

나) 질량분석기 조건

(1) Ionizationmode: ESI(positive)

(2) Interface temperature: 300℃

(3) Interface voltage: 4.0 kV

(4) Collision gas: Ar(아르곤)

(5) 분석대상물질의 조건

물질명 (Compound)	머무름 시간 (분)	이온화 (Ionization mode)	관측질량 (Exact mass)	선구이온 (Precursor ion,m/z)	생성이온 (Product ion,m/z)	충돌에너지 (Collision energy, eV)
페닐부타존(Phenylbutazone)	6.90	Positive	308.2	309.2	120	18
					160	18
					190	14

※ 밑줄 표시되어 있는 것은 정량이온이며 그 외 이온들은 정성이온임.

8) 정성 및 확인시험

가) 정성 및 확인

위의 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크는 표준용액 피크의 머무름 시간과 비교하여일치하여야 한다. 또한 표준용액과 시험용액의 선구이온(precursor ion) 및 생성이온(product ion)이 일치하여야 하고, 표준용액과 시험용액의 생성이온간 반응세기의 비율(ion ratio)을 비교하여 그 비율은 주1)과 일치하여야 한다.
확인시험의 경우, 음성시료 (blank sample)에 해당 물질을 넣은 것을 시료와 동일하게 전처리하여 얻은 표준용액 으로서 비교한다.

주1)생성이온간 반응세기의 비율 허용범위

이온간 반응세기의 비율 (Base peak에 대한 %)	허용범위
> 50%	± 20%
> 20%, ≤ 50%	± 25%
> 10%, ≤ 20%	± 30%

나) 표준품 첨가시료 크로마토그램

그림 1. 페닐부타존(6.9분)첨가시료의 크로마토그램(0.005 mg/kg)

9) 정량시험

가) 정량

조직표준곡선(tissue standard curve) 작성을 위하여 각 해당 물질이 검출되지 않은 음성시료(blank sample) 2 g씩 준비한 후 음성시료(blank sample)를 포함하여 5개 이상의 농도로 전처리하여 표준용액을 제조한다. 각 농도별 첨가시료에서 얻어진 크로마토그램상의 각 피크 높이 또는 면적을 구하여 검량선을 작성한 후, 시험용액의 크로마토그램으로부터 정량이온(quantitative ion)의 각 피크 높이 또는 피크 면적에 따라 산출된 시험용액 중 검출농도,시료량과 최종 시험용액의 부피를 고려하여 정량한다.

나) 정량한계

페닐부타존(Phenylbutazone): 0.005 mg/kg