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▶ 제 8. 일반시험법 ▶ 8. 식품 중 잔류동물용의약품시험법 ▶ 8.3 정량시험법 ▶ 8.3.48 데하이드로콜산(Dehydrocholic acid), 안트라닐산(Anthranilic acid)
  • 8.3.48 데하이드로콜산(Dehydrocholic acid), 안트라닐산(Anthranilic acid)

    1) 시험법 적용범위

    축‧수산물 등에 적용한다(단, 데하이드로콜산은 축산물에만 적용한다).

    2) 분석원리

    시료중의 분석대상물질을10 mM 포름산암모늄(ammonium formate) 함유 아세토니트릴로추출하고 헥산으로 정제하여 액체크로마토그래프/질량분석기로 분석한다.

    3) 장치

    액체크로마토그래프/질량분석기(LC-MS/MS)

    4) 시약 및 시액

    가) 용매: 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것

    나) 물: 3차 증류수 또는 이와 동등한 것

    다) 표준원액: 각 표준품을 메탄올에 녹여 조제한 용액을 표준원액으로 한다.

    라) 혼합표준용액:각각의 표준원액을 잔류허용기준 또는 검출에 적합한 농도가 되도록 메탄올로 희석하여 사용한다.

    마) 10 mM 포름산암모늄 함유 아세토니트릴: 1,000 mL 용량플라스크에포름산암모늄 0.63 g을넣고 물 20mL로 잘 녹인 뒤 아세토니트릴로 표시선까지 채운다.

    바) 0.1% 포름산(formic acid) 수용액: 1,000 mL 용량플라스크에포름산1 mL를 넣고 물로 표시선까지 채운다.

    사) 0.1% 포름산 함유 아세토니트릴:1,000 mL 용량플라스크에포름산1 mL를 넣고 아세토니트릴로 표시선까지 채운다.

    아) 기타시약: 특급 또는 이와 동등한 것

    5) 시험용액의 조제

    균질화한 시료5 g을 50 mL 원심분리관에 취하고10 mM 포름산암모늄 함유 아세토니트릴20 mL를넣고15분간흔들어 섞은 후,4℃, 2,600G에서 15분간 원심분리한다. 상층액을50 mL 원심분리관에 취하고 헥산 20 mL를넣고10분간흔들어 섞은 후4℃, 2,600G에서15분간 원심분리한다. 하층액을 15 mL 원심분리관에 취하고40℃ 이하에서0.5 mL가 될 때까지 질소농축한다.농축액에 0.1% 포름산 함유 아세토니트릴1.5 mL를넣고 녹인 뒤4℃, 15,000G에서 10분간 원심분리하여 상층액을 0.45 μmPTFE (polytetrafluoroethylene) 멤브레인필터로 여과시킨것을 시험용액으로 한다.

    6) 시험조작

    가) 액체크로마토그래프 측정조건

    (1)컬럼: C18(2.1 mm × 100 mm, 3.5 μm)또는 이와 동등한 것

    (2) 이동상

    (가) 이동상 A:0.1% 포름산 수용액

    (나) 이동상 B:0.1% 포름산 함유 아세토니트릴

    시간(분)

    이동상 A(%)

    이동상 B(%)

    0

    100

    0

    3

    100

    0

    5

    5

    95

    15

    5

    95

    17

    100

    0

    20

    100

    0

    (3) 유속: 0.2 mL/분

    (4)컬럼온도: 30℃

    (5) 주입량: 10 μL

    나) 질량분석기 조건

    (1) Ionization mode: ESI(positive, negative)

    (2) Capillary temperature: 350℃

    (3) Collision gas: N2(질소)

    (4) 분석대상물질의 개별조건

    연번

    물질명

    (Compound)

    머무름 시간

    (분)

    이온화

    (Ionization mode)

    관측질량

    (Exact mass)

    선구이온

    (Precursor

    ion,m/z)

    생성이온

    (Product

    ion,m/z)

    충돌에너지

    (Collision energy, eV)

    1

    데하이드로콜산 (Dehydrocholic acid)

    10.19

    Negative

    402.2

    401.2

    249.3

    44

    331.3

    24

    215.3

    46

    2

    안트라닐산

    (Anthranilic acid)

    9.70

    Positive

    137.1

    138.2

    91.8

    20

    65.0

    44

    120.0

    50

    ※ 밑줄 표시되어 있는 것은 정량이온이며 그 외 이온들은 정성이온임

    7) 정성시험

    가) 정성 및 확인

    위의 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크는 표준용액 피크의 머무름 시간과 비교하여일치하여야 한다. 또한 표준용액과 시험용액의 선구이온(precursor ion) 및 생성이온(product ion)이 일치하여야 하고, 표준용액과 시험용액의 생성이온간 반응세기의 비율(ion ratio)을 비교하여 그 비율은 주1)과 일치하여야 한다.
    확인시험의 경우, 음성시료 (blank sample)에 해당 물질을 넣은 것을 시료와 동일하게 전처리하여 얻은 표준용액 으로서 비교한다.

    주1)생성이온간 반응세기의 비율 허용범위

    이온간 반응세기의 비율

    (Base peak에 대한 %)

    허용범위

    > 50%

    ± 20%

    > 20%, ≤ 50%

    ± 25%

    > 10%, ≤ 20%

    ± 30%

    나) 표준품 크로마토그램

    데하이드로콜산(Dehydrocholic acid)

    안트라닐산(Anthranilic acid)

    그림 1. 데하이드로콜산(10.19분), 안트라닐산(9.70분) 표준품의 크로마토그램(각 0.01 mg/L)

    8) 정량시험

    가) 정량

    조직표준곡선(tissue standard curve) 작성을 위하여 각 해당 물질이 검출되지 않은 음성시료(blank sample) 5 g씩 준비한 후 음성시료(blank sample)를 포함하여 5개 이상의 농도로 전처리하여 표준용액을 제조한다. 각 농도별 첨가시료에서 얻어진 크로마토그램상의 각 피크 높이 또는면적을 구하여 검량선을 작성한 후, 시험용액의 크로마토그램으로부터 정량이온(quantitative ion)의 각 피크 높이 또는 피크 면적에 따라 산출된 시험용액 중 검출농도,시료량과 최종 시험용액의 부피를 고려하여 정량한다.

    나) 정량한계

    데하이드로콜산(Dehydrocholic acid): 0.005 mg/kg

    안트라닐산(Anthranilic acid): 0.005 mg/kg