10.1.8 유전자변형감자(New Leaf Plus, New Leaf Y)

유전자변형 감자는 10.1.3 DNA의 추출․정제법 10.1.3.2.3 감자 및 그 가공품의 시험방법에 따라 2회 반복 추출하여 얻은 DNA 용액을 사용하며, 10.1.5 정성분석방법의 정성 PCR 방법에 따라 다음의 프라이머를 사용하여 PCR을 실시한다. 유전자변형 감자에 사용되는 프라이머는 현재 Nippon Gene 사에서 제작하여 시판하고 있으며(표 3 참조), 그 밖에 이와 동등한 결과를 얻을 수 있는 프라이머를 설계하여 사용할 수 있다.

가. New Leaf Plus 검출용 프라이머

1) 내재성 유전자를 확인하기 위하여 Pss 01n 프라이머를 사용한다.

F-primer(Pss 01n-5') : 5'-TGA CCT GGA CAC CAC AGT TAT-3'

R-primer(Pss 01n-3') : 5'-GTG GAT TTC AGG AGT TCT TCG A-3'

2) New Leaf Plus의 1차 검출용 프라이머는 다음과 같다.

F-primer(p-FMV02-5') : 5'-AAA TAA CGT GGA AAA GAG CTG TCC TGA-3'

R-primer(PLRV01-3') : 5'-AAA AGA GCG GCA TAT GCG GTA AAT CTG-3'

3) New Leaf Plus의 2차 확인용 프라이머로 PLRV-rep1-5'과 PLRV-rep1-3' 프라이머를 사용한다.

나. New Leaf Y 검출용 프라이머

1) 내재성 유전자를 확인하기 위하여 Pss 01n 프라이머를 사용한다.

F-primer(Pss 01n-5') : 5'-TGA CCT GGA CAC CAC AGT TAT-3'

R-primer(Pss 01n-3') : 5'-GTG GAT TTC AGG AGT TCT TCG A-3'

2) New Leaf Y의 1차 검출용 프라이머로 p-FMV05-5'과 PVY02-3' 프라이머를 사용한다.

3) New Leaf Y의 2차 확인용 프라이머로 pVY01-5'과 pVY01 -3' 프라이머를 사용한다.

다. 결과의 판정

내재성 유전자를 확인하기 위해 프라이머를 사용한 것에서 216 bp의 PCR 증폭산물이 검출되고 New Leaf Plus 및/또는 New Leaf Y 1차 검출용 프라이머를 사용한 것에서 234 bp 및/또는 225 bp의 PCR 증폭산물이 검출된 경우, 다시 동일한 DNA 추출액에 대하여 New Leaf Plus 및/또는 New Leaf Y 2차 확인용 프라이머를 사용하여 PCR을 실시한다. 이 때 172 bp 및/또는 161 bp의 PCR 증폭산물이 확인된 경우 “New Leaf Plus 및/또는 New Leaf Y 검출”이라고 판정하며, 두개의 DNA 추출액 중 하나라도 “New Leaf Plus 및/또는 New Leaf Y 검출”이라고 판정된 경우 해당 검체는 “New Leaf Plus 및/또는 New Leaf Y 검출”이라고 최종 판정한다. 또한 두개의 DNA 추출액 중 하나의 추출액에서 내재유전자에 해당하는 PCR 증폭산물이 검출되지 않은 경우에는 다시 전기영동을 실시하여 PCR 증폭산물을 확인하고, 역시 내재유전자에 해당하는 PCR 증폭산물이 검출되지 않은 경우에는 그 추출액에서의 결과를 무시하고 다른 DNA 추출액의 결과만으로 판정한다. 두 개의 DNA 추출액에서 모두 내재유전자에 대응하는 PCR 증폭산물을 검출할 수 없는 경우에는 다시 DNA 추출을 1회 실시하여 PCR 후 판정한다. 재차 추출한 DNA 추출액에서도 내재유전자에 대응하는 PCR 증폭산물이 검출되지 않을 때는 “검사불능”으로 판정한다. 판정 예시는 표 7과 같다.