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▶ 제 8. 일반시험법 ▶ 10. 식품표시 관련 시험법 ▶ 10.1 유전자재조합식품의 시험법 ▶ 10.1.13 유전자변형 사탕무, 알팔파
  • 10.1.13 유전자변형 사탕무, 알팔파(alfalfa)

    사탕무, 알팔파 또는 그 가공식품에 대하여 실시간 PCR 장치를 사용하여 유전자변형 사탕무와 알팔파를 검출하기 위한 정성 및 정량분석법이다.

    가. DNA의 추출

    10.1.3 DNA의 추출․정제법에 따르며, 알팔파의 경우 10.1.3.3 알팔파 DNA 추출법에 따라 2회 반복 추출하여 얻은 DNA 용액을 사용한다.

    나. 시약 및 시액

    1) 프라이머와 프로브

    유전자변형 사탕무와 알팔파 검출에 사용되는 프라이머와 프로브는 표 17과 같으며, 이와 동등한 결과를 얻을 수 있는 프라이머와 프로브를 사용할 수도 있다.

    2) 실시간 PCR용 반응액의 조제

    표 17의 프라이머와 프로브를 사용하면서 PCR 반응액의 총량을 25μL로 할 경우 PCR 반응액 조성은 표 18, 19와 같다. 다만, PCR 반응액 조성은 프라이머와 프로브 또는 실시간 PCR 기기에 따라 다를 수 있으므로 시약이나 기기의 사용 매뉴얼을 참고하여 적용한다. 각 PCR 반응 시에 사용하여야 하는 음성대조군과 양성대조군 등 그 외 사항은 10.1.11 유전자변형 면화 나. 시약 및 시액 2) 실시간 PCR용 반응액의 조제에 따른다.

    이벤트

    (증폭산물크기)

    프라이머/

    프로브

    염기서열

    농도 (nM)

    사탕무

    (121 bp)

     

    GruA3 F-5'

    5'-GAC CTC CAT ATT ACT GAA AGG AAG-3'

    150

    GruA3 R-3'

    5'-GAG TAA TTG CTC CAT CCT GTT CA-3'

    150

    GruD1 probe-Taq

    5'-FAM-CTA CGA AGT TTA AAG TAT GTG CCG CTC-TAMRA-3'

    100

    알팔파

    (127 bp)

     

    pef1-85F-5'

    5'-TAC GTC CAA TCC CAA CGC C-3'

    450

    pef1-211R-3'

    5'-GGC CTT TTG CTG GTA ATC TAC AAA C-3'

    450

    pef1-110P-Taq

    5'-FAM-ACC GTG ACT GCA GCA TCT CTG GCA-TAMRA-3'

    210

    사탕무 H7-1

    (110 bp)

    H7PLT1-5'

    5'-TGG GAT CTG GGT GGC TCT AAC T-3'

    400

    ZRH7-R2-3'

    5'-AAT GCT GCT AAA TCC TGA G-3'

    400

    ZRH7-probe-Taq

    5'-FAM-AAG GCG GGA AAC GAC AAT CT -TAMRA-3'

    200

    알팔파 J101

    (121 bp)

    J101-F12-5'

    5'-CTG ATC TTG TGT CAT AGT TTC AAA CAC TG-3'

    450

    J101-R11-3'

    5'-GCT TTG GAC TGA GAA TTA GCT TCC A-3'

    600

    J101-P11-Taq

    5'-FAM-AAC TGA AGG CGG GAA ACG ACA ATC TG-TAMRA-3'

    200

    알팔파 J163

    (105 bp)

    J163-F1-5'

    5'-GAG GCT TTG GAC TGA GAA TTA GCT T-3'

    450

    J163-R3-3'

    5'-CAA GGT CAT CCA AAC TGA AGT GTT C-3'

    450

    J163-P1-Taq

    5'-FAM-CAC TCG AGC AGG ACC TGC AGA AGC TT-TAMRA-3'

    180

     

    알팔파 KK179

    (88 bp)

    KK179 primer1

    5'-GAA GCT AGC TTG ATG GGG ATC AGA-3'

    450

    KK179 primer2

    5'-AAA GTA ACT AGG CTA AAG TAA GAT ATC GAA GA-3'

    450

    KK179 probe

    5'-FAM-AAG AGG TTT TGA AGG CGG GAA ACG ACA-TAMRA-3'

    100

    표 17. 유전자변형 사탕무, 알팔파의 PCR 검사에 사용되는 프라이머와 프로브

    * 후대교배종은 후대교배종을 구성하는 이벤트의 프라이머/프로브를 사용하여 검사한다.

    표 18. 유전자변형 사탕무 검사용 실시간 PCR 반응액 조성

    성 분

    최종 농도(well)

    1회 분량(μL)

    Universal Master Mix (2 X)1)

    1 X

    12.5

    프라이머 (각 10 μM)

    150 nM ~ 400 nM

    0.375 ~ 1

    Probe (10 μM)

    100 nM ~ 200 nM

    0.25 ~ 0.5

    주형 DNA (10 ng/μL)

    50 ng

    5

    멸균증류수

    반응 총액이 25 μL가 되도록 첨가

    전체량

     

    25

    1)Universal Master Mix 또는 이와 동등한 시약을 사용할 수 있다.

    표 19. 유전자변형 알팔파 검사용 실시간 PCR 반응액 조성

    성 분

    최종 농도(well)

    1회 분량(μL)

    Universal Master Mix (2 X)1)

    1 X

    12.5

    프라이머 (각 10 μM)

    450 nM ~ 600 nM

    1.125 ~ 1.5

    Probe (10 μM)

    100 nM ~ 210 nM

    0.25 ~ 0.525

    주형 DNA (20 ng/μL)

    100 ng

    5

    멸균증류수

    반응 총액이 25 μL가 되도록 첨가

    전체량

     

    25

    1)Universal Master Mix 또는 이와 동등한 시약을 사용할 수 있다.

    다. 시험 조작(실시간 PCR 장치에 의한 정성 및 정량분석)

    사탕무의 PCR 반응조건은 표 20과 같고 알팔파의 PCR 반응조건은 표 21과 같으며, 그 외 사항은 10.1.11 유전자변형 면화 다. 시험 조작(실시간 PCR 장치에 의한 정성분석) 및 10.1.6 정량시험에 따른다.

    표 20. 유전자변형 사탕무 검사에 사용되는 실시간 PCR 반응 조건

     

    온도

    시간

    결과수집

    cycle 수

    전 반응

    (Pre-PCR incubation)

    50℃

    2분

    No

    1 cycle

    초기 변성

    (Initial denaturation)

    95℃

    10분

    No

    1 cycle

    증폭

    (Amplification)

    95℃

    15초

    No

    50 cycles

    60℃

    1분

    Yes

     

    온도

    시간

    결과수집

    cycle 수

    전 반응

    (Pre-PCR incubation)

    50℃

    2분

    No

    1 cycle

    초기 변성

    (Initial denaturation)

    95℃

    10분

    No

    1 cycle

    증폭

    (Amplification)

    95℃

    15초

    No

    45 cycles

    60℃

    1분

    Yes

    라. 분석결과의 판정

    유전자변형 사탕무 및 알팔파에 대한 분석결과의 판정은 10.1.11 유전자변형 면화 라. 정성분석결과의 판정 및 10.1.6 정량시험 사. 결과의 판정에 따른다. 다만, 사탕무의 경우 PCR cycle 수가 50이므로 모든 NTC의 Ct 값이 50이어야 하며, 추출 DNA 시료액 별로 3 반복 시험한 결과, 2개 이상의 웰(well)에서 Ct 값이 50 미만이면서 지수함수적인 증폭이 확인되는 경우 해당 DNA 시료액이 양성이라고 판정한다.