α-아세토락테이트디카복실라아제

α-Acetolactate decarboxylase

 

정    의  이 품목은 Bacillus brevis의 α-아세토락테이트디카복실라아제 유전자가 삽입된 Bacillus subtilis의 배양물에서 얻어진 효소이다. 다만, 역가조정, 품질보존 등을 위하여 희석제, 안정제 등을 첨가할 수 있다.

  이 품목은 α-아세토락테이트의 카복실기를 디카복실화하여 아세토인과 이산화탄소를 생성한다.

성    상  이 품목은 백～진한 갈색의 분말, 입상, 페이스트상 또는 무～진한 갈색의 액상이다.

확인시험  이 품목의 활성시험법에 따라 시험할 때 활성을 나타내어야 한다.

순도시험  (1) 비소 : 이 품목을 비소시험법에 따라 시험할 때, 그 양은 4.0ppm 이하이어야 한다.

  (2) 납 : 이 품목 5.0g을 취하여 원자흡광광도법 또는 유도결합플라즈마발광광도법에 따라 시험할 때, 그 양은 5.0ppm 이하이어야 한다.

  (3) 대장균군 : 이 품목은 「식품의 기준 및 규격」 일반시험법의 미생물시험법 중 대장균군에 따라 시험할 때, 제품 1g당 30 이하이어야 한다.

  (4) 살모넬라 : 이 품목은 「식품의 기준 및 규격」 일반시험법의 미생물시험법 중 살모넬라에 따라 시험할 때, 음성(-)이어야 한다.

  (5) 대장균 : 이 품목은 「식품의 기준 및 규격」 일반시험법의 미생물시험법 중 대장균에 따라 시험할 때, 음성(-)이어야 한다.

활성시험법(역가)

  분석원리 : 본 역가시험은 아래의 시험조작 조건하에서 α-아세토락테이트디카복실라아제를 α-아세토젖산에 작용시켜 생성된 아세토인을 1-나프톨 및 크레아틴의 혼합물과 정색반응을 시켜 반응물의 흡광도를 측정하는데 근거를 두고 있다.

  시험용액의 조제 : 검체를 MES․Brij35•염화나트륨의 혼합액에 녹여 최종 희석액 1mL가 0.025～0.075 ADU를 함유하도록 시험용액을 조제한다.

  시험조작 : 시험용액, MES완충액 및 기질용액을 30℃수욕조에서 미리 10분간 항온시킨다. 효소공시험용(B1)은 시험용액 0.2mL 및 MES완충액 0.2mL를 각각 정확히 취하여 시험관에 넣고 흔들어 섞어 준 다음 즉시 30℃에서 정확히 20분간 방치한다. 효소시험용(H₁)은 시험용액 0.2mL 및 기질용액 0.2mL를 각각 정확히 취하여 시험관에 넣고 흔들어 섞어 준 다음 즉시 30℃에서 정확히 20분간 방치한다. 완충액공시험용(B₂)는 MES․Brij35․염화나트륨의 혼합액 0.2mL 및 MES완충액 0.2mL를 각각 정확히 취하여 시험관에 넣고 흔들어 섞어 준 다음 즉시 30℃에서 정확히 20분간 방치한다. 완충액시험용(H₂)는 MES․Brij35․염화나트륨의 혼합액 0.2mL 및 기질용액 0.2mL를 각각 정확히 취하여 시험관에 넣고 흔들어 섞어 준 다음 즉시 30℃에서 정확히 20분간 방치한다. 정확히 20분 후에 각각의 시험관에 발색액 4.6mL씩을 가해주고 흔들어 혼합한 다음 실온에서 정확히 40분간 방치한 후 파장 522nm에서 흡광도를 측정하여 효소공시험액(B₁), 효소시험액(H₁), 완충액공시험액(B₂) 및 완충액시험액(H₂)의 흡광도를 각각 측정한다.

  검량선의 작성 : 미리 아세토인 0.1g을 정밀히 달아 물을 가하여 100mL로 하고, 이 액 1, 2, 4, 6 및 8mL를 각각 정확히 취하여 각각에 물을 가하여 100mL씩으로 한다. 이 액 0.4mL씩을 정확히 취하여 각 시험관에 넣고 발색액 4.6mL 씩을 가해주고 흔들어 혼합한 다음 실온에서 정확히 40분간 방치한 후 파장 522nm에서 각각의 흡광도를 측정하고 아세토인의 농도(μg/mL)에 대한 검량선을 작성한다.

     다음 계산식에 따라 효소제의 역가를 구한다.

 

역가(ADU/g)	=	ΔA×F	×	5.0	×	1	×	1	×	1
		88.1				20		0.2		W

 

      ΔA : (H₁ - B₁) - (H₂ - B₂)

      F : 검량선으로부터 구한 흡광도 1 당 아세토인의 농도(μg/mL)

      88.1 : 아세토인의 분자량

      5.0 : 최종 반응액의 양(mL)

      20 : 반응시간(분)

      0.2 : 시험용액의 채취량(mL)

      W : 시험용액 1mL에 함유된 검체의 양(g)

  역가의 정의 : 1 α-Acetolactate decarboxylase unit(ADU)는 상기시험조건 하에서 1분간에 1μmol의 아세토인을 유리시키는 효소의 양이다.

  시  액

    MES완충액(0.05M, pH 6.0) : MES[2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid] 9.76g을 900mL의 물에 녹인 다음 1N 수산화나트륨용액으로 pH를 6.0으로 조절하고 물을 가하여 1,000mL로 한다. 이 액은 상온에서 2주간 안정하다.

    15% Brij35용액 : Brij35(Polyoxyethylene lauryl ether) 15.0g에 물 70mL를 가해주고 60℃로 가온하면서 녹여 주고 식히 다음 물을 가하여 100mL로 한다. 이 액은 냉장 보존시에 2개월간 안정하다.

    MES․Brij35․염화나트륨의 혼합액 : MES 48.8g 및 염화나트륨 175.32g을 약 4,500mL의 물에 녹이고 이에 15% Brij35용액 17mL를 가해 주고 1N 수산화나트륨용액으로 pH를 6.0으로 조절한 후 물을 가하여 5,000mL로 한다. 이 액은 상온에서 2주간 안정하다.

    기질용액 : 50mL플라스크에 Ethyl-2-acetoxy-2-methylacetolactate (Aldrich No. 220396 또는 이와 동등한 것) 100μL를 취하여 넣고 0.5N 수산화나트륨용액 6mL를 가한 다음 20분간 저어주면서 용해한다. 이에 MES완충액 40mL를 가해 주고 0.5N 염산으로 pH를 6.0으로 조절한 다음 MES완충액을 가하여 50mL로 한다. 이 액은 사용 시 조제한다.

    발색액 : 1-나프톨(1-Naphthol) 5.0g 및 크레아틴(Creatine) 0.5g을 1N 수산화나트륨용액에 녹여 500mL로 한다. 이 액은 사용 시 조제한다.

보존기준

  냉암소에서 밀봉 보존하여야 한다.