아스파라지나아제

Asparaginase

 

정    의  이 품목은 Aspergillus oryzae 및 Aspergillus niger의 배양물에서 얻어진 효소제이다. 다만, 역가조정, 품질보존 등을 위하여 희석제, 안정제 등을 첨가할 수 있다.

  이 품목은 L-아스파라진을 가수분해하여 L-아스파트산과 암모니아를 생성한다.

성    상  이 품목은 백～진한 갈색의 분말, 입상, 페이스트상 또는 무～진한 갈색의 액상이다.

확인시험  이 품목의 활성시험법에 따라 시험할 때 활성을 나타내어야 한다.

순도시험  (1) 비소 : 이 품목을 비소시험법에 따라 시험할 때, 그 양은 4.0ppm 이하이어야 한다.

  (2) 납 : 이 품목 5.0g을 취하여 원자흡광광도법 또는 유도결합플라즈마발광광도법에 따라 시험할 때, 그 양은 5.0ppm 이하이어야 한다.

  (3) 대장균군 : 이 품목은 「식품의 기준 및 규격」일반시험법의 미생물시험법 중 대장균군에 따라 시험할 때, 제품 1g당 30 이하이어야 한다.

  (4) 살모넬라 : 이 품목은 「식품의 기준 및 규격」일반시험법의 미생물시험법 중 살모넬라균시험법에 따라 시험할 때, 음성(-)이어야 한다.

  (5) 대장균 : 이 품목 25g을 취하여 「식품의 기준 및 규격」일반시험법의 미생물시험법 중 대장균에 따라 시험할 때, 음성(-)이어야 한다.

활성시험법(역가)

Aspergillus oryzae의 배양물에서 얻어진 효소제는 제 1 법, Aspergillus niger의 배양물에서 얻어진 효소제는 제 2 법을 각각 적용한다.

제 1 법

  분석원리 : 본 역가시험은 pH 7.0, 온도 37℃에서 L-아스파라진(L-asparagine)의 가수분해로 생성된 암모니아를 측정하는 방법으로 이 때 생성된 암모니아는 α-ketoglutarate와 결합하여 L-글루탐산을 생성하며, 이 과정에서 소비되는 NADH(Nicotineamide adenine dinucleotide, reduced)의 소비량을 측정하는데 근거를 두고 있다.

  시험용액의 조제 : 검체 일정량을 취하여 최종 희석액 1mL가 0.4～1.0 ASNU를 함유하도록 MOPS완충액으로 희석한 액을 시험용액으로 한다(흡광도가 약 0.10～0.25의 범위가 되도록 조정한다).

  시험조작 : 기질용액 2.4mL를 시험관에 넣고 37±0.1℃의 수욕조에서 미리 10분간 방치한 후 시험용액 0.1mL를 가해주고 즉시 흔들어 섞은 다음 1mL를 정확히 취하여 액층 1cm 셀에 넣고, 미리 항온시켜 둔 Triton X-100을 함유한 0.1M MOPS완충액(pH 7.0)을 공시험용으로 하여 파장 340nm에서 흡광도를 신속하게 측정한다. 반응시작 시점으로 부터 3분에서 5분까지 2분간 10초 간격으로 흡광도를 측정한다(반응시작 시점의 흡광도는 2.3～2.8 범위가 되어야 하며, 2.3 이하인 경우는 기질용액을 새로 조제한다). 시험조작을 상기와 동일하게 2회 이상 반복하여 분당 흡광도 곡선의 기울기(ΔA/min)를 구한다. 이 때 기울기는 15% 이내에서 일치하여야 한다.

     다음 계산식에 따라 효소제의 역가를 구한다.

 

역가(ASNU/g) =	ΔA/min × 2.5 × D
	0.1 × 6.3 × 1 × W

 

ΔA/min : 시험용액의 분당 흡광도 감소값
2.5 : 최종반응액의 양(mL)
D : 검체의 희석배수
0.1 : 사용된 시험용액의 양(mL)
6.3 : NADH의 흡광계수(mL․µmol-1․cm-1)
1.0  : 흡광셀의 길이(cm)
W : 검체의 채취량(g)
 

  역가의 정의 : 1 Asparaginase unit(ASNU)는 상기시험조건 하에서 1분당 1µmol의 암모니아를 생성하는 효소의 양이다.

  시  액

    4M 수산화나트륨용액 : 수산화나트륨 16g에 물을 가하여 100mL로 하고 완전히 녹을 때까지 흔들어 준다.

    0.1M MOPS완충액(pH 7.0) : MOPS(Sigma M1254 또는 이와 동등한 것) 20.9g을 물 약 950mL에 녹이고 4M 수산화나트륨용액으로 pH를 7.0으로 맞춘 후 Triton X-100 (Sigma T9284 또는 이와 동등한 것) 1mL를 가한 다음 물을 가하여 1,000mL로 한다. 이 액은 사용 시 조제한다.

    기질용액 : L-아스파라진(Sigma A7094 또는 이와 동등한 것) 0.25g을 달아 25mL 플라스크에 넣고, 이에  MOPS완충액(pH 7.0) 20mL를 가하여 완전히 용해시킨 후 NADH(Roche 107735 또는 이와 동등한 것) 0.011g을 가한다. 다시 이에 α-ketoglutarate(Sigma K3752 또는 이와 동등한 것) 0.063g과 Glutamate dehydrogenase(Fluka 49392 또는 이와 동등한 것) 2,000단위 이상을 가해 주고 MOPS완충액(pH 7.0)을 가하여 25mL로 한다. 이 액 1mL에는 L-asparagine 10mg, α-ketoglutarate 2.5mg, NADH 0.44mg, Glutamate dehydrogenase 80 Unit 이상이 함유되어 있다. 이 용액은 상온에서 2시간 동안 안정하다.

제 2 법

  분석원리 : 본 역가시험은 L-asparagine 가수분해로 생성된 암모니아를 측정하는 방법으로, 이 때 생성된 암모니아를 페놀-니트로프루시드(phenol nitroprusside)용액과 알카리성차아염소산염(alkaline hypochlorite)과 반응시켜 나타나는 청색의 흡광도를 파장 600nm에서 측정하는데 근거를 두고 있다.

  시험용액의 조제 : 검체 일정량을 취하여 0.1M 구연산완충액(pH 5.0)을 사용하여 최종 희석액 1mL가 6 ASNU를 함유하도록 시험용액을 조제한다.

  검량선의 작성 : 황산암모늄 3.0g을 정밀히 달아 0.1M 구연산완충액(pH 5.0) 40mL에 교반하여 녹인 다음 50mL로 하고, 이 액 1mL, 2mL, 5mL, 10mL 및 15mL를 정확히 취하여 0.1M 구연산완충액(pH 5.0)을 가하여 각각 50mL로 한 액을 각 표준용액으로 한다. 각 액 1mL는 1.2, 2.4, 6, 12 및 18mg/mL의 황산암모늄을 함유한다. 5개의 시험관에 기질용액 2mL를 넣고 37±0.1℃수욕조에서 미리 10분간 항온시킨 다음, 각각의 표준용액 0.1mL를 정확히 취하여 넣고 즉시 흔들어 섞어주고 37±0.1℃에서 정확히 30분간 방치한다. 삼염화초산용액 0.4mL를 가하고 흔들어 섞은 다음 물 2.5mL를 가하여 반응액으로 한다. 별도의 시험관에 물 0.8mL를 넣고 반응액 20μL를 가하여 섞어주고 페놀-니트로프루시드용액 170μL를 넣고 섞어준 후 0.2% 알칼리성차아염소산용액 170μL를 가하여 섞어준다. 각 액을 37±0.1℃ 수욕조에서 10분간 방치한 다음 파장 600nm에서 흡광도를 측정하고 표준용액의 농도(mg/mL)에 대한 검량선을 작성한다.

  시험조작 : 기질용액 2mL를 정확히 취하여 시험관에 넣고 37±0.1℃의 수욕조에서 미리 10분간 항온시킨 다음, 시험용액 0.1mL를 가해주고 즉시 흔들어 섞어 준 후 37±0.1℃에서 정확히 30분간 방치한다. 삼염화초산용액 0.4mL를 가하고 흔들어 섞은 다음, 물 2.5mL를 가하여 반응액으로 한다. 별도의 시험관에 물 0.8mL를 넣고 반응액 20μL를 가하여 섞어주고 페놀-니트로프루시드용액 170μL를 넣고 섞어준 후 0.2% 알칼리성차아염소산용액 170μL를 가하여 섞어준다. 이 액을 37±0.1℃수욕조에서 10분간 방치한 다음 파장 600nm에서 효소반응액의 흡광도(A_T)를 측정한다. 따로, 시험관에 기질용액 2mL와 삼염화초산용액 0.4mL를 가하고 흔들어 섞은 다음 시험용액 0.1mL를 가하여 37±0.1℃에서 정확히 30분간 방치한 후, 물 2.5mL를 가하고 별도의 시험관에 물 0.8mL를 넣고 반응액 20μL를 가하여 섞어주고 페놀-니트로프루시드용액 170μL를 넣고 섞어준 후 알칼리성차아염소산용액 170μL를 가하여 섞어준다. 이 액을 37±0.1℃수욕조에서 10분간 방치한 다음 파장 600nm에서 효소공시험용액 흡광도(A_B)를 측정한다. 

    다음 계산식에 따라 효소제의 역가(ASNU/g)를 구한다.

 

역가(ASNU/g)	=	(AT - AB) × V × D × 2 × 106
		a × 132.14 × W × 30 × 103

 

  A_T : 효소반응액의 흡광도

  A_B : 효소공시험용액의 흡광도

  V : 시험용액의 초기 부피(mL)

  D : 검체의 희석배수

  a : 검량선의 기울기(mL/mg)

  W : 검체의 채취량(g)

  30 : 반응시간 (분) 

  역가의 정의 : 1 Asparaginase unit(ASNU)는 상기시험조건 하에서 1분당 1µmol의 암모니아를 생성하는 효소의 양이다.

  시  액

    기질용액 : L-아스파라진(1수염) 1.5g을 0.1M 구연산완충액(pH 5.0) 80mL에 완전히 녹인 후 100mL로 한다. 이 액은 사용 시 조제한다. 

    4M 수산화나트륨용액 : 수산화나트륨 160g을 물 800mL에 녹인 후 물을 가하여 1,000mL로 한다.

    0.1M 구연산완충액(pH 5.0) : 구연산(1수염) 21.01g을 물 900mL에 녹인 후 4M 수산화나트륨용액으로 pH를 5.0로 조정한 후 물을 가하여 1,000mL로 한다.

    삼염화초산용액 : 삼염화초산 25g을 물을 가하여 100mL로 한다.

보존기준

  냉암소에서 밀봉 보관하여야 한다.