풀루라나아제

Pullulanase

 

정    의 이 품목은 Bacillus acidopullulyticus, Klebsiella aerogenes, Bacillus licheniformis, Pullulanibacillus naganoensis의 배양물, Bacillus deramificans의 풀루라나아제 유전자가 삽입된 Bacillus subtilis의 배양물, Bacillus deramificans의 풀루라나아제 유전자가 삽입된 Bacillus licheniformis의 배양물, Bacillus acidopullyticus의 풀루라나아제 유전자가 삽입된 Bacillus subtilis의 배양물에서 얻어진 효소제이다. 다만, 역가조정, 품질보존 등을 위하여 희석제, 안정제 등을 첨가할 수 있다.

  이 품목은 풀루란, 아밀로펙틴, 글리코겐 등의 α-1,6-글리코시드 결합을 가수분해하여 플루란에서는 말토트리오스를 생성하고, 아밀로펙틴 등에서는 아밀로오스 형태의 직쇄 다당류를 생성한다.

성    상  이 품목은 백～진한 갈색의 분말, 입상, 페이스트상 또는 무～진한 갈색의 액상이다.

확인시험  이 품목의 활성시험법에 따라 시험할 때 활성을 나타내어야 한다.

순도시험  (1) 비소 : 이 품목을 비소시험법에 따라 시험할 때, 그 양은 4.0ppm 이하이어야 한다.

  (2) 납 : 이 품목 5.0g을 취하여 원자흡광광도법 또는 유도결합플라즈마발광광도법에 따라 시험할 때, 그 양은 5.0ppm 이하이어야 한다.

  (3) 대장균군 : 이 품목은 「식품의 기준 및 규격」 일반시험법의 미생물시험법 중 대장균군에 따라 시험할 때, 제품 1g당 30 이하이어야 한다.

  (4) 살모넬라 : 이 품목은 「식품의 기준 및 규격」 일반시험법의 미생물시험법 중 살모넬라균 시험법에 따라 시험할 때, 음성(-)이어야 한다.

  (5) 대장균 : 이 품목은 「식품의 기준 및 규격」일반시험법의 미생물시험법 중 대장균에 따라 시험할 때, 음성(-)이어야 한다.

활성시험법(역가)

  분석원리 : 본 역가시험은 pH 5.0, 온도 50℃에서 pullulan의 α-1,6-glycosidic 결합을 가수분해하여 생성된 환원당인 maltotriose를 디니트로살리실산과 반응시켜 흡광도측정법으로 측정하는데 근거를 두고 있다.

  시험용액의 조제 : 검체를 물에 녹여 다음의 시험방법에 따라 시험할 때, 흡광도 값이 0.2～0.5범위에 들도록 시험용액을 조제한다.

  시험조작 : 17×1.5cm 시험관을 효소시험용으로 하여 기질용액 1mL를 넣는다. 이를 50℃의 수욕조에서 5분간 정치하고, 시험관에 시험용액 1mL를 가해주고 나서 정확히 10분간 반응시킨 다음 3,5-디니트로살리실산시액 2mL를 가하여 반응을 정지시킨다. 별도의 효소공시험용 시험관에 기질용액 1mL 및 3,5-디니트로살리실산시액 2mL를 넣고, 이에 시험용액 1mL를 가해준다. 시험관 모두를 끓는 수욕조에서 5분간 끓여주고 신속하게 냉각시킨 후 물 10mL를 가해주고 잘 흔들어 준다. 효소공시험용액을 대조액으로 하여 액층 1cm，파장 540nm에서 효소시험용액의 흡광도를 측정한다.

  검량선의 작성 : 맥아당(표준품) 1g을 정밀히 달아 물을 가하여 100mL로 한 다음 이 액 1.0, 1.2, 1.4, 1.6, 1.8, 2.0mL를 각각 취하고 이에 물을 가하여 20mL씩으로 한 것을 표준용액으로 한다. 시험용액 1mL대신에 표준용액 1mL와 물 1mL를 각각 사용하여 시험용액과 동일조작을 행한다. 물을 사용한 것을 대조액으로 하여 각각의 흡광도를 측정하고 표준용액의 농도(mg/mL)에 대한 흡광도로 검량선을 작성한다.

      다음 계산식에 따라 효소제의 역가를 구한다.

 

역가(units/mL) ＝	C	×	1,000
			시험용액의 농도(mg/mL) × 10

        C : 검량선에서 얻어진 효소시험용액의 맥아당농도(mg/mL)
        10 : 반응시간

  역가의 정의 : 1 Pullulanase unit는 상기시험조건 하에서 분당 무수맥아당 1mg에 상당하는 환원당을 생성하는 효소의 양이다.

  시   액

    기질용액 : 풀루란(Pullulan)표준품 1g에 물 70mL를 가하여 5분간 가열하고 식힌 다음 이에 1M 초산•초산나트륨완충액(pH 5.0) 10mL를 가해주고 나서 물을 가하여 100mL로 한다.

    1M 초산•초산나트륨완충액(pH 5.0)

      A 액 : 초산 60g을 물에 녹여 500mL로 한다.

      B 액 : 초산나트륨(무수) 82g을 물에 녹여 500mL로 한다.

      A 액 148mL와 B 액 352mL를 혼합하고 A 액 또는 B 액을 사용하여 pH 5.0으로 조절하고 물을 가하여 전량을 1,000mL로 한다.

    3,5-디니트로살리실산(3,5-Dinitrosalicylic acid, DNS)시액 : DNS 1g을 취하여 10% 수산화나트륨용액 16mL를 가하여 녹여 주고 이에 주석산칼륨나트륨(4수화물) 30g 및 물 50mL를 넣고 가열하여 녹인 다음 물을 가하여 100mL로 한다. 이 액은 5℃에서 보존하고 5일 이내에 사용한다.

보존기준

  냉암소에서 밀봉 보존하여야 한다.