2-15 착색료 시험법

가. 분석원리
시료에서 용출되는 착색료를 박층크로마토그래프, 여지크로마토그래프, 액체크로마토그래프 등으로 측정한다.
 
나. 산성색소
물을 침출용액으로 하여 시료에서 용출된 색소를 산성 상태에서 탈지양모에 염색된 산성색소에 적용한다.
1) 장치
가) 실리카겔 또는 폴리아미드 박층 : 박층크로마토그래피용
나) 여지(거름종이) : 여지크로마토그래피용
다) 전개조
라) 액체크로마토그래프-광다이오드배열 검출기(HPLC-PDA)
2) 시약 및 시액
가) 탈지양모
(1) 1법 : 백색양모 100 g을 강암모니아수 1∼4 mL를 적당히 물로 희석한 용액 중에 담그고 가끔 저으면서 45℃에서 30∼60분간 방치한 다음 건져내어 가볍게 짜고 다음에 희석한 암모니아수(1→100)에 잠시 방치하였다가 건져내어 처음에는 온탕, 다음에는 냉수로 씻고 가볍게 짜서 바람에 말린다.
(2) 2법 : 속슬렛추출장치에서 석유 에테르로 백색양모를 충분히 탈지한 다음 에테르를 실온에서 증발시켜 물로 충분히 씻고 가볍게 짜서 바람에 말린다.
나) 전개용매
(1) 박층크로마토그래피(실리카겔 박층)
(가) 초산에틸：메탄올：28% 암모니아수(4.5:1:1 또는 3:1:1)
(나) 아밀알코올：에탄올：28% 암모니아수(10:10:1)
(다) 메틸에틸케톤：에틸렌글리콜모노메틸에테르：에탄올：28% 암모니아수(20:15:12:1)
(2) 박층크로마토그래피(폴리아미드 박층)
(가) 메탄올：에탄올：이소아밀알코올：28% 암모니아수(15:10:5:3)
(나) 피리딘：메탄올：28% 암모니아수：물(5:6:1:16)
(3) 여지크로마토그래피
(가) 아세톤：이소아밀알코올：물(6：5：5)
(나) n-부탄올：무수에탄올：1% 암모니아수(6：2：3)
(다) 25% 에탄올용액：5% 암모니아수(1：1)
다) 색소표준용액 : 색소표준원액을 물에 녹여 적정 농도가 되도록 희석하여 사용한다. 단, 4) 시험조작 중 다)항에 따를 경우 색소표준원액을 10 mM 아세트산암모늄 용액으로 희석하여 사용한다.
3) 시험용액의 조제
물을 침출용액으로 하여 2-6 재질별 용출시험용액의 조제에 따라 조제한 액 20 mL에 1%초산 1 mL를 가하고 탈지양모 0.1 g을 넣고 잘 흔들어 섞은 다음 수욕 중에서 30분간 가온한 다음 양모를 건져내어, 양모가 염색되지 않으면 불검출로 하고 양모가 염색되면 이 염색된 양모를 1% 암모니아용액 5 mL 중에 넣고 30분간 가온한 다음 양모를 건져내고 초산으로 중화하여 농축한 액을 시험용액으로 한다.
4) 시험조작
가) 박층크로마토그래피
실리카겔 또는 폴리아미드 박층의 하단에서 2 cm의 일직선상에 시험용액 및 색소표준용액을 직경 약 3 mm로 1 cm의 간격으로 찍고 말린다. 이를 박층의 하단 0.5∼1 cm를 전개용매에 담그고 8∼15 cm 전개시킨다. 전개가 끝나면 시험용액과 색소표준용액에서 얻은 반점의 위치와 색을 자연광 및 자외선(약 365 nm) 조사 하에서 비교 관찰한다.
나) 여지크로마토그래피
크로마토그래피용 여과지의 끝에서 40 mm의 곳에 연필로 줄을 긋고 그 위에 시험용액과 색소표준용액을 각각 20 mm의 간격으로 미량 피펫 또는 모세관으로 직경 약 5 mm의 원이 되게 찍고 말린다. 이 여과지를 규정의 전개용매를 넣은 용기에 여과지가 기벽에 닿지 않도록 주의하여 수직으로 매달고 하단 약 10 mm를 전개용매 중에 담그고 뚜껑을 닫고 방치한다. 용매가 반점에서 13∼25 cm의 높이까지 상승하였을 때 여과지를 건져내어 말린 다음 시험용액과 색소표준용액으로부터 전개된 반점의 위치와 색을 자연광 및 자외선(약 365 nm) 조사 하에서 비교 관찰한다.
다) 액체크로마토그래피
(1) 측정조건
- 칼럼 : C ₁₈(4.6 mm I.D. × 250 mm, 5 μm) 또는 이와 동등한 것
- 칼럼온도 : 40℃
- 검출기 : 광다이오드배열 검출기(PDA, 파장 : 350∼650 nm)
- 이동상 : A : 10 mM 아세트산암모늄 용액, B : 아세토니트릴
- 농도기울기 : A : B(95 : 5)에서 A : B(50 : 50)까지의 직선 농도기울기를 30분간 실시한다. 필요에 따라 적절히 조절한다.
- 유속 : 분당 1 mL
(2) 정성시험
시험용액, 표준용액 각각 10 μL씩 사용하여 (1) 측정조건에 따라 액체크로마토그래피를 행하고, 시험용액 크로마토그램의 피크검출시간과 표준용액 크로마토그램의 각 성분의 피크검출시간이 일치하는지 확인한다.
(3) 정량시험
(2) 정성시험에서 시험용액 크로마토그램의 피크검출시간과 표준용액 크로마토그램의 각 성분의 피크검출시간이 일치할 때에는 (2) 정성시험에서 얻어진 시험결과를 토대로 시험용액 및 표준용액 크로마토그램의 각 성분의 피크면적을 측정하여 미리 작성한 검량선을 이용하여 시험용액 중 착색료의 양을 구한다.
 
다. 모든 색소
2-6 재질별 용출시험용액의 조제에 따라 용출된 착색료에 적용한다.
1) 장치
가) 액체크로마토그래프-광다이오드배열 검출기
나) 액체크로마토그래프-질량분석기/질량분석기
2) 표준용액
색소표준품 10 mg씩 정밀히 달아 메탄올에 녹여 10 mL로 한 액을 각각의 표준원액으로 한다(1,000 mg/L). 표준원액 0.1 mL를 취하여 10 mL 용량플라스크에 넣고 메탄올을 가하여 10 mL로 한다(10 mg/L). 이 액 0.1 mL를 취하여 10 mL 용량플라스크에 넣고 메탄올을 가하여 10 mL로 한 액을 표준용액으로 한다(0.1 mg/L).
3) 시험용액의 조제
2-6 재질별 용출시험용액의 조제에 따라 조제한 액을 시험용액으로 한다. 다만, 침출용액으로 n-헵탄을 사용하여 조제한 시험용액의 경우 시험용액 2 mL를 취하여 40℃에서 질소 건고한 후 메탄올 2 mL를 가하여 잔류물을 녹여 최종 시험용액으로 한다.
4) 시험조작
가) 액체크로마토그래피
(1) 측정조건
- 칼럼 : C ₁₈(3.0 mm I.D. × 150 mm, 3 μm) 또는 이와 동등한 것
- 칼럼온도 : 35℃
- 검출기 : 광다이오드배열 검출기(파장 : 350∼650 nm)
- 이동상 : A : 0.1% 개미산, B : 메탄올
- 농도기울기 : A : B(100 : 0)에서 A : B(0 : 100)까지의 직선 농도기울기를 30분간 실시한다. 필요에 따라 적절히 조절한다.
- 유속 : 분당 0.3 mL
(2) 정성시험
시험용액, 표준용액 각각 10 μL씩 사용하여 (1) 측정조건에 따라 액체크로마토그래피를 행하고, 시험용액 크로마토그램의 피크검출시간과 표준용액 크로마토그램의 각 성분의 피크검출시간이 일치하는지 확인한다.
(3) 정량시험
(2) 정성시험에서 시험용액 크로마토그램의 피크검출시간과 표준용액 크로마토그램의 각 성분의 피크검출시간이 일치할 때에는 (2) 정성시험에서 얻어진 시험결과를 토대로 시험용액 및 표준용액 크로마토그램의 각 성분의 피크면적을 측정하여 미리 작성한 검량선을 이용하여 시험용액 중 착색료의 양을 구한다.
나) 액체크로마토그래프-질량분석기/질량분석기
(1) 측정조건
- 칼럼 : C ₁₈(2.1 mm I.D. × 50 mm, 1.8 μm) 또는 이와 동등한 것
- 칼럼온도 : 35℃
- 검출기 : 질량분석기/질량분석기
· 이온화방법 : 전자분무이온화(ESI, +)
· 이온소스 온도 : 200 ℃
· 충돌가스 : N2
· 충돌전압 : 10∼100 V
- 이동상 : A : 0.1% 개미산, B : 메탄올
- 농도기울기 : A : B(100 : 0)에서 A : B(0 : 100)까지의 직선 농도기울기를 30분간 실시한다. 필요에 따라 적절히 조절한다.
- 유속 : 분당 0.3 mL
※ 색소 및 질량분석기 특이이온(예시)

	물질명	Precursor Ion (m/z)	Fragment Ion (m/z)
1	Solvent Yellow 14	249.1	93.0, 186.9
2	Solvent Yellow 16	279.1	93.1, 148.9
3	Solvent Yellow 33	274.1	104.9, 76.8
4	Solvent Yellow 56	254.2	77.0, 133.9
5	Solvent Yellow 82	695.1	373.9, 120.0
6	Solvent Yellow 93	359.2	77.0, 132.8
7	Solvent Yellow 98	556.8	103.8, 380.9
8	Solvent Yellow 114	290.1	215.9, 241.9
9	Solvent Yellow 185	334.2	290.1, 233.8
10	Solvent Green 3	419.2	293.0, 106.9
11	Solvent Green 5	453.2	295.0, 99.8
12	Solvent Orange 3	213.1	77.0, 120.7
13	Solvent Orange 7	277.1	121.2, 198.9
14	Solvent Orange 60	271.1	243.0, 139.9
15	Solvent Orange 63	337.1	307.9, 275.9
16	Solvent Orange 86	240.9	181.0, 162.9
17	Solvent Red 1	278.8	123.2, 107.7
18	Solvent Red 3	293.1	121.1, 76.8
19	Solvent Red 23	353.0	77.0, 127.8
20	Solvent Red 24	381.1	91.0, 223.8
21	Solvent Red 26	395.0	349.1, 316.8
22	Solvent Red 27	409.2	104.8, 91.0
23	Solvent Red 48	786.6	742.5, 701.4
24	Solvent Red 111	237.8	223.0, 219.9
25	Solvent Red 122	728.0	390.2
26	Solvent Red 135	408.9	236.8, 331.0
27	Solvent Red 179	321.1	292.0, 263.8
28	Solvent Red 195	500.2	186.1, 215.2
29	Solvent Red 197	382.2	338.1, 309.4
30	Solvent Red 242	296.7	253.0, 239.8
31	Solvent Violet 11	239.1	166.1, 139.1
32	Solvent Violet 13	329.9	312.2, 252.1
33	Solvent Violet 59	423.1	346.0, 240.9
34	Solvent Blue 35	351.2	251.0, 294.0
35	Solvent Blue 36	323.0	265.2, 280.0
36	Solvent Blue 97	531.1	383.0, 516.5
37	Solvent Blue 101	419.2	327.1, 106.8
38	Solvent Blue 104	475.2	355.0, 106.8
39	Solvent Black 3	457.2	194.2, 246.3
40	Solvent Black 27	423.2	358.9, 409.0

 
(2) 정성시험
시험용액, 색소표준용액을 각각 10 μL씩 사용하여 1) 액체크로마토그래프-질량분석기/질량분석기 측정조건에 따라 액체크로마토그래피/질량분석을 행하고, 시험용액 크로마토그램의 피크검출시간과 표준용액 크로마토그램의 각 성분의 피크검출시간이 일치하는지 확인한다.
(3) 정량시험
(2) 정성시험에서 시험용액 크로마토그램의 피크검출시간과 표준용액 크로마토그램의 각 성분의 피크검출시간이 일치할 때에는 (2) 정성시험에서 얻어진 시험결과를 토대로 시험용액 및 표준용액 크로마토그램의 각 성분의 피크면적을 측정하여 미리 작성한 검량선을 이용하여 시험용액 중 착색료의 양을 구한다.