9.13.2 오르리스타트(Orlistat)
가. 시험법의 적용범위
모든 식품에 적용한다.
나. 분석원리
균질화한 검체를 취하여 액-액 추출하고 액체크로마토그래프/자외선흡광검출기(UV photometric detector), PDA검출기로 분석한다.
다. 장치
액체크로마토그래프/자외선흡광검출기(HPLC/UV photometric detector), PDA검출기(HPLC/PDA), 액체크로마토그래프/질량분석기(LC/MS)를 사용한다.
라. 시약 및 시액
1) 유기용매 : 액체크로마토그래피용 또는 이와 동등한 것
2) 물 : 액체크로마토그래피용 또는 이와 동등한 것
3) 표준원액 : 오르리스타트 표준품 20 mg을 정밀히 취하여 20 mL 용량 플라스크에 넣고 아세토니트릴에 녹여 정용한다.
4) 표준용액 : 표준원액을 메탄올에 녹여 1∼100 mg/L의 범위가 되도록 적당한 농도로 희석한다.
마. 시험용액의 조제
균질화한 검체 약 1 g을 정확히 달아 50 mL 용량 플라스크로 넣고 물 15 mL를 가하여 습윤화한다. 메스플라스크에 메탄올 25mL를 가하여 10분간 초음파 추출한 후 메탄올로 눈금을 채우고 0.45 μm 막 여과지(membrane filter)로 여과하여 시험용액으로 사용한다. 단, 시험용액의 농도가 검량곡선의 농도범위를 벗어날 경우 농도 범위내로 희석하여 사용한다.
바. 시험조작
1) 액체크로마토그래프의 측정조건
가) 칼럼 : C18(4.6 mm × 250 mm, 5 μm) 또는 이와 동등한 것
나) 칼럼온도 : 40℃
다) 이동상
(1) 이동상 A : 0.5 mM sodium-1-hexane sulfonate를 함유한 0.1% 인산용액
(2) 이동상 B : 95% 아세토니트릴
| 시간(분) |
이동상 A(%) |
이동상 B(%) |
| 0 |
85 |
15 |
| 6 |
85 |
15 |
| 15 |
70 |
30 |
| 30 |
60 |
40 |
| 32 |
60 |
40 |
| 42 |
0 |
100 |
| 50 |
0 |
100 |
| 52 |
85 |
15 |
| 60 |
85 |
15 |
라) 이동상 유속 : 1.2 mL/min
마) UV 검출기파장 : 195 nm
바) PDA 검출기파장 : 190∼400 nm
2) 검량선 작성
표준용액을 농도별로 일정량 취하여 액체크로마토그래프에 각각 주입한다. 얻어진 크로마토그램상의 각 피이크 높이 또는 면적을 구하여 검량선을 작성한다.
3) 표준품의 크로마토그램 및 스펙트럼
(a) 오르리스타트의 크로마토그램
(b) 오르리스타트의 스펙트럼
4) 정량한계 : 25 mg/kg
사. 정성시험
위의 조건에서 얻어진 크로마토그램상의 피이크는 동일한 측정조건에서 표준용액 피이크의 머무름 시간(retention time)과 일치하여야 하며 PDA검출기에서 표준용액과 시험용액이 동일한 스펙트럼을 보여야 한다.
아. 정량시험
정성시험과 동일한 조건에서 얻어진 시험결과를 피이크 높이법 또는 피이크 면적법에 따라 정량한다.
1) 계산방법
검량곡선에서 얻어진 표준물질의 피이크 높이 또는 피이크 면적을 Y축으로 하고 표준물질의 농도를 X축으로 하여 검량곡선을 작성하고, 시험용액의 높이 또는 면적을 Y축에 대입하여 오르리스타트의 농도를 계산한다.
| 오르리스타트의 함량(mg/g) = C × |
V |
× D |
| S |
C : 검량곡선에서 계산된 오르리스타트의 농도 (mg/L)
V : 시험용액의 최종 부피 (L)
S : 검체 채취량 (g)
D : 희석배수
자. 확인시험
액체크로마토그래프/질량분석기로 분석하였을 때 시험용액 중 표준물질의 m/z 값은 표준용액 중 표준물질의 m/z 값과 일치하여야 한다.
1) 액체크로마토그래프/질량분석기의 측정조건
가) 칼럼 : C18(2.0 mm × 100 mm, 3 μm) 또는 이와 동등한 것
나) 칼럼온도 : 40℃
다) 이동상
(1) 이동상 A : 0.1% formic acid
(2) 이동상 B : 0.1% formic acid를 함유한 아세토니트릴
| 시간(분) |
이동상 A(%) |
이동상 B(%) |
| 0 |
95 |
5 |
| 3 |
95 |
5 |
| 20 |
20 |
80 |
| 21 |
95 |
5 |
| 25 |
95 |
5 |
라) 이동상 유량 : 0.3 mL/min
마) 이온화 방법 : ESI
바) capillary temperature : 340℃
사) spray voltage : 4.0 kV
아) scan range : 200∼800 amu
자) MRM transition
| 물질 |
분자량 |
Ion mode |
Precursor ion (m/z) |
Fragment ion (m/z) |
| 오르리스타트 (C29H53NO5) |
495.39 |
positive |
496 |
319, 160, 114 |