9.15.5 카스카로사이드(Cascaroside A, B, C, D)
가. 시험법의 적용범위
모든 식품에 적용한다.
나. 분석원리
균질화한 검체를 취하여 액-액 추출하고 액체크로마토그래프/ 자외부흡광검출기(UV photometric detector), PDA 검출기로 분석한다.
다. 장치
1)액체크로마토그래프/자외부흡광검출기(LC/UV photometric detector), PDA 검출기(LC/PDA),
액체크로마토그래프/질량분석기(LC/MS)를 사용한다.
라. 시약 및 시액
1) 유기용매 : 액체크로마토그래피용 또는 이와 동등한 것
2) 물 : 액체크로마토그래피용 또는 이와 동등한 것
3) 표준원액 : 카스카로사이드 A(cascaroside A), 카스카로사이드 B(cascaroside B), 카스카로사이드 C(cascaroside C), 카스카로사이드 D(cascaroside D) 표준품을 각각 메탄올에 녹여 1,000 mg/L이 되게 한다.
4) 표준용액 : 표준원액을 메탄올에 녹여 1～100 mg/L의 범위가 되도록 적당한 농도로 희석한다.
5) sodium-1-hexane sulfonate : 이온쌍 크로마토그래피용
6) 기타시약 : 잔류농약 시험용 또는 이와 동등한 것
마. 시험용액의 조제
균질화한 검체 1 g을 정확히 달아 50 mL 용량의 메스플라스크에 넣고 물 15 mL를 가하여 습윤화한다. 메스플라스크에 메탄올 25 mL를 가하여 10분간 초음파 추출한 후 메탄올로 눈금을 채우고 0.45 ㎛ 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 사용한다. 단, 시험용액의 농도가 검량곡선의 농도범위를 벗어날 경우 농도 범위내로 희석하여 사용한다.
바. 시험조작
1) 액체크로마토그래프의 측정조건
가) 컬럼 : C18(4.6 mm × 250 mm, 5 ㎛) 또는 이와 동등한 것
나) 컬럼온도 : 40℃
다) 이동상
(1) 이동상 A : 0.5 mM sodium-1-hexane sulfonate를 함유한 0.1% 인산 용액
(2) 이동상 B : 95% 아세토니트릴
| 시간(분) |
이동상 A(%) |
이동상 B(%) |
| 0 |
85 |
15 |
| 6 |
85 |
15 |
| 15 |
70 |
30 |
| 30 |
60 |
40 |
| 32 |
60 |
40 |
| 42 |
0 |
100 |
| 50 |
0 |
100 |
| 52 |
85 |
15 |
| 60 |
85 |
15 |
라) 이동상 유량 : 1.2 mL/min
마) UV 검출기파장 : 291 nm
바) PDA 검출기파장 : 200～400 nm
2) 검량선의 작성
표준용액을 농도별로 일정량 취하여 액체크로마토그래프에 각각 주입한다. 얻어진 크로마토그램상의 각 피크 높이 또는 면적을 구하여 검량선을 작성한다.
3) 표준품의 크로마토그램 및 스펙트럼
(a) 카스카로사이드 A, B, C, D의 크로마토그램
(b) 카스카로사이드 A, B의 스펙트럼
(C) 카스카로사이드 C, D의 스펙트럼
4) 정량한계 : 25 mg/kg
사. 정성시험
위의 조건에서 얻어진 크로마토그램상의 피크는 동일한 측정조건에서 표준용액 피크의 머무름 시간과 일치하여야 하며 PDA 검출기에서 표준용액과 시험용액이 동일한 스펙트럼을 보여야 한다.
아. 정량시험
정성시험과 동일한 조건에서 얻어진 시험결과를 피크 높이법 또는 피크 면적법에 따라 정량한다.
1) 계산방법
검량곡선에서 얻어진 표준물질의 피크 높이 또는 피크 면적을 Y축으로 하고 표준물질의 농도를 X축으로 하여 검량곡선을 작성하고 시험용액의 높이 또는 면적을 Y축에 대입하여 카스카로사이드의 농도를 계산한다.
| 시료 중 함량(mg/g) = C × |
V |
× D |
| S |
C : 검량곡선에서 계산된 카스카로사이드의 농도 (mg/L)
V : 시험용액의 최종 부피 (L)
S : 검체 채취량 (g)
D : 희석배수
자. 확인시험
액체크로마토그래프/질량분석기로 분석하였을 때 시험용액 중 표준물질의 m/z 값은 표준용액 중 표준물질의 m/z 값과 일치하여야 한다.
1) 액체크로마토그래프/질량분석기의 측정조건
가) 컬럼 : C18(2.0 mm × 100 mm, 3 ㎛) 또는 이와 동등한 것
나) 컬럼온도 : 40℃
다) 이동상
(1) 이동상 A : 0.1% formic acid를 함유한 물
(2) 이동상 B : 0.1% formic acid를 함유한 아세토니트릴
| 시간(분) |
이동상 A(%) |
이동상 B(%) |
| 0 |
95 |
5 |
| 3 |
95 |
5 |
| 18 |
20 |
80 |
| 18.1 |
0 |
100 |
| 20.9 |
0 |
100 |
| 21 |
95 |
5 |
| 25 |
95 |
5 |
라) 이동상 유량 : 0.3 mL/min
마) 이온화 방법 : ESI
바) capillary temperature : 340℃
사) spray voltage : 4.0 kV
아) MRM transition
| 물질 |
분자량 |
Ion mode |
Precursor ion (m/z) |
Fragment ion (m/z) |
| 카스카로사이드 A (C27H32O14) |
580.1 |
Negative |
579 |
297, 459 |
| 카스카로사이드 B (C27H32O14) |
580.1 |
Negative |
579 |
297, 459 |
| 카스카로사이드 C (C27H32O13) |
563.8 |
Negative |
563 |
281, 443 |
| 카스카로사이드 D (C27H32O13) |
563.8 |
Negative |
563 |
281, 443 |